本发属于微生物发酵领域，尤其涉及一种红豆杉固态发酵培养基及其制备方法和红豆杉固态发酵方法。
背景技术：
紫杉烷类化合物是提取于高等裸子植物红豆杉的树皮、根和叶等部位的一类化合物，主要含有紫杉醇、三尖杉宁碱、10-DABⅢ、7-木糖基紫杉醇等，有许多已被证明具有细胞毒性和抗肿瘤活性，而用来提取紫杉醇等的天然红豆杉资源有限，因而天然紫杉醇原料药的生产和供应受到限制，远远不能满足紫杉醇临床的应用。
固态发酵(Solid-state fermentation，简称SSF)是指利用自然底物做碳源及能源，或利用惰性底物做固体支持物，其体系无水或接近于无水的任何发酵过程，固体发酵技术发展已久，应用广泛。在古代中国就已经被应用在制曲酿酒、腌制食品、肥料堆积等方面。受科技发展的限制，在过去的很长一段时间内固体发酵技术都停留在一个比较原始落后的状态，甚至在现代的工业生产上仍然在沿用这样的发酵技术。在最近二十年间，关于固体发酵技术的研究和应用得到了迅速发展，人们在固态发酵领域的研究及其在资源环境、蛋白质饲料中的应用取得了进展，主要表现在生物饲料、生物燃料、生物农药、生物转化、生物解毒及生物修复等方面的应用。目前还没有专利利用微生物和红豆杉采用固体发酵技术，增加红豆杉紫杉醇的含量。
固态发酵本身具有如下优点：培养基简单且来源广泛，多为便宜的天然基质或工业生产的下脚料；投资少，能耗低，技术较简单；产物的产率较高；基质含水量低，可大大减少生物反应器的体积，不需要废水处理，环境污染较少，后处理加工方便；发酵过程一般不需要严格的无菌操作；通气一般可由气体扩散或间歇通风完成，不需要连续通风，空气一般也不需严格的无菌空气。
所以为提高紫杉醇的产量及质量、降低紫杉醇的生产成本，可以对其进行固态发酵进行研发以满足临床日益增长的需求。
技术实现要素：
本发明的目的是为了提供一种提高红豆杉紫杉醇产量、降低其生产成本的红豆杉固态发酵培养基及其制备方法和红豆杉固态发酵方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种红豆杉固态发酵培养基包括A培养基和B培养基，其中A培养基包括如下重量份：红豆杉枝叶粉末100份、麸皮40-50g份、豆粕4-5份、大米粉10份；
B培养基包括如下重量份：蛋白胨2份、酵母浸膏1-2份、氯化钠5份、磷酸二氢钾0.3份、硫酸镁0.2份、葡萄糖8-10份、土豆汁，所述土豆汁体积与所述氯化钠质量的比为20mL：1g。
进一步优选的，所述A培养基包括如下重量份：红豆杉枝叶粉末100份、麸皮50g份、豆粕5份、大米粉10份；
所述B培养基包括如下重量份：：蛋白胨2份、酵母浸膏1份、氯化钠5份、磷酸二氢钾0.3份、硫酸镁0.2份、葡萄糖10份、土豆汁，所述土豆汁体积与所述氯化钠质量的比为20mL：1g。
上述红豆杉固态发酵培养基的制备方法包括如下步骤：将红豆杉粉末用甲醛熏蒸至少12h后与麸皮、豆粕、大米粉混合均匀即得A培养基；
将新鲜土豆去皮切块，用5倍切块土豆质量的水煮沸至少30min，然后用纱布过滤，滤液自然冷却至室温后用蒸馏水定容至5倍切块土豆质量的水对应的体积得土豆汁；
将蛋白胨、酵母浸膏、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁和葡萄糖用土豆汁溶解后，用氢氧化钠调节pH至7，即得B培养基。
进一步优选的，所述的氢氧化钠浓度为3mol/L。
一种利用上述红豆杉固态发酵培养基进行的红豆杉固态发酵方法包括如下步骤：
A.培养基准备：将制备好的B培养基与A培养基中的麸皮、豆粕和大米粉混合均匀后灭菌，灭菌后的混合物与甲醛熏蒸后的红豆杉粉末混合均匀即得培养基，将培养基装于容器中，厚度为0.8-1.2cm；
B.菌种液的制备：将斜面菌种接种于装有PDB培养基的已灭菌的容器中，在温度为28℃、搅拌速度200rpm/min条件下恒温培养60-80h，制得种子液；
C.接种及培养：将种子液按质量分数1％-5％的量接入已制备好的培养基中，于26-32℃温度下静置培养6-10天；
所述菌种编号为CPCC 800037，保存于中国药学微生物菌种保藏管理中心。
进一步的，所述步骤A中灭菌条件为：温度为121℃、压力为0.1MPa灭菌锅内灭菌20min。
进一步优选的，所述步骤B中恒温培养时间为72h。
进一步的，所述步骤B中种子液接入培养基后，在培养基上盖上纱布并捆扎结实。
进一步优选的，所述步骤A中培养基的厚度为1cm。
采用本发明提供的培养基对红豆杉进行发酵能有效提高发酵培养产物中紫杉醇的含量，且该方法为首次尝试对红豆杉进行固体发酵，对紫杉醇生产行业具有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。所述实施例仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例中用于制备含红豆杉粉末固体真菌发酵培养基的红豆杉枝叶粉末为本公司种植的曼地亚红豆杉枝叶经过风干粉碎而得，其他各项成分可通过市购的方式获得。
实施例一
培养基配置：将红豆杉粉末100g用甲醛熏蒸12h备用。
制备B培养基：制备土豆汁：将200g新鲜土豆去皮切块，用1L的水煮沸30min，然后用4层纱布过滤，过滤液自然冷却至室温后用蒸馏水定容至1L备用，pH为自然。
将蛋白胨2g，酵母浸膏1g，氯化钠5g，磷酸二氢钾0.3g，硫酸镁0.2g，葡萄糖10g溶于100ml土豆汁中，用3mol/L的氢氧化钠调节pH至7，备用。
将制备好的B培养基与A培养基除红豆杉粉末以外的其余成分混合均匀，121℃、0.1Mpa灭菌锅20分钟后冷却，将熏蒸后的红豆杉粉末100g与灭菌后的培养基混合均匀备用。
接种：将摇瓶培养的菌种液按质量分数3％的量接入已制备好的培养基中，于30℃条件下培养7天，用甲醇提取，HPLC测定紫杉醇含量。
实施例二
培养基配置：将红豆杉粉末100g用甲醛熏蒸12h备用。
制备B培养基：制备土豆汁：将200g新鲜土豆去皮切块，用1L的水煮沸30min，然后用4层纱布过滤，过滤液自然冷却至室温后用蒸馏水定容至1L备用，pH为自然。
将蛋白胨2g，酵母浸膏1g，氯化钠5g，磷酸二氢钾0.3g，硫酸镁0.2g，葡萄糖10g溶于100ml土豆汁中，用3mol/L的氢氧化钠调节pH至7，备用。
将制备好的B培养基与A培养基除红豆杉粉末以外的其余成分混合均匀，121℃、0.1Mpa灭菌锅20分钟后冷却，将熏蒸后的红豆杉粉末100g与灭菌后的培养基混合均匀备用。
菌种液制备：将斜面菌种，接种于装有PDB培养基的已灭菌的三角瓶中，28℃、200rpm/min，恒温培养3天，制得种子液备用。
接种：将摇瓶培养的菌种液按质量分数1％的量接入已制备好的培养基中，于32℃条件下培养10天，用甲醇提取，HPLC测定紫杉醇含量。
实施例三
培养基配置：将红豆杉粉末100g用甲醛熏蒸12h备用。
制备B培养基：制备土豆汁：将200g新鲜土豆去皮切块，用1L的水煮沸30min，然后用4层纱布过滤，过滤液自然冷却至室温后用蒸馏水定容至1L备用，pH为自然。
将蛋白胨2g，酵母浸膏1g，氯化钠5g，磷酸二氢钾0.3g，硫酸镁0.2g，葡萄糖10g溶于100ml土豆汁中，用3mol/L的氢氧化钠调节pH至7，备用。
将制备好的B培养基与A培养基除红豆杉粉末以外的其余成分混合均匀，121℃、0.1Mpa灭菌锅20分钟后冷却，将熏蒸后的红豆杉粉末100g与灭菌后的培养基混合均匀备用。
菌种液制备：将斜面菌种，接种于装有PDB培养基的已灭菌的三角瓶中，28℃、200rpm/min，恒温培养3天，制得种子液备用。
接种：将摇瓶培养的菌种液按质量分数5％的量接入已制备好的培养基中，于28℃条件下培养6天，用甲醇提取，HPLC测定紫杉醇含量。
以同批未发酵红豆杉枝叶，用甲醇提取，HPLC测定紫杉醇含量作为对照，各实施例的对照数据如表1所示。
表1紫杉醇含量对比结果