利用微生物疫苗提高酿酒酵母溶剂胁迫耐受性和发酵性能的方法与流程

本发明涉及微生物胁迫耐受性与发酵领域，涉及一种微生物疫苗处理菌体的方法。

背景技术：

在酿酒酵母发酵过程中会出现乙醇、高温、氧化胁迫等一系列逆境条件，特别是乙醇的毒害作用尤为明显，菌体会出现停滞生长甚至死亡的现象，严重影响到主产物乙醇的收率，因此，本领域迫切需要一种低成本、简易的方法来提高工业酿酒酵母的胁迫耐受性特别是乙醇耐受性。

现有提高乙醇胁迫的方法包括菌种改良、培养基成分优化、发酵工艺优化(过程工程)等。在菌种改良上包括驯化、传统诱变、现代基因工程或代谢工程方法等。但传统诱变方法与驯化方法效率低、工作强度大，容易出现回复突变；现代基因工程的方法实现乙醇耐受性提高是非常困难的，因为乙醇耐受性是菌体的一种复杂表型，相关的调控基因多达几百个，涉及的亚细胞结构改变包括细胞膜上甾醇含量变化、膜流动性与通透性改变、胞内液泡等离子亚平衡、胞内海藻糖类物质积累、核糖体功能的精微变化、RNA膜孔截留等。而且因为筛选方法的限制，乙醇耐受性与乙醇发酵性能有时还存在矛盾，即乙醇耐受性提高的菌株有时牺牲了发酵强度参数。过程工程角度控制可以选择反应器类型与排布，如反应器串联；但若使用固定化细胞，会带来传质的问题；使用氧化还原电位控制，主要存在附属部件复杂与通氧等问题；而其他分离主产物乙醇的方法，如气提方法或膜分离耦合方法，无疑会大大增加能耗与设备成本。

综合考虑现有技术存在的优缺点，如果能在培养过程中实现添加某种物质而显著提高细胞乙醇耐受性将对本领域具有巨大的意义。

技术实现要素：

为弥补现有技术的不足，本发明提供一种利用微生物疫苗提高酿酒酵母溶剂胁迫耐受性和发酵性能的方法。

本发明的技术构思是：考虑到乙醇作用于细胞首先靶点为细胞膜，而信号传导过程也依赖于膜表面受体，而糖类及其衍生物往往与信号从膜往胞内传导直接相关，可能与乙醇信号响应网络产生重叠。因此发明人尝试使用糖及其衍生物来处理细胞，激发相应代谢网络改变，使其像人类打疫苗一样，先受到相应刺激，提早一步引发所谓免疫反应，等细胞再次置于乙醇胁迫条件下可以迅速应对。这为低成本、高效提高乙醇耐受性、发酵性能提供了新的思路。

发明人采用的微生物疫苗中脂多糖(LPS)效果最为显著，其存在于革兰阴性细菌的外膜，由脂类和多糖组成，来源十分广泛。多糖又分为O多糖和核心(中心)多糖。目前，对LPS的研究多存在于动物细胞，宿主细胞对LPS的应答曾被认为是细胞病理、生理和药理学活性的一个从启动到终止的过程。现人们已认识到LPS能“识别”靶细胞并诱导其产生和释放具有免疫活性的细胞因子和其它宿主炎症反应介质，多用在损伤或病理模型构建上，还未见其与微生物胁迫耐受相关的研究报道。在注射剂药物中要求LPS的含量要低于国家标准5EU/(kg·h)，而本发明中添加的量远低于这一上限，且燃料乙醇生产中采用精馏方式获得乙醇终产品，不会将发酵液中的LPS带入产品，因此可以保证产品安全性。

本发明的技术方案是：利用微生物疫苗提高酿酒酵母溶剂胁迫耐受性和发酵性能的方法，在酵母细胞发酵或抗溶剂胁迫之前，将微生物疫苗加入到酵母培养物中，微生物疫苗的终浓度为0.001EU-1.0EU。

优选的，所述的微生物疫苗为脂多糖。

更具体地，上述方法为：取处于对数生长期后期至稳定期前期的酿酒酵母过夜培养物，离心，弃上清，用缓冲液洗涤后向培养物中加入微生物疫苗于其最适培养温度处理0.5-2h，最适宜培养温度如本发明实施例中提到的30℃。该处理过程相当于给酵母细胞打了疫苗，让其可以提前应对接下来受到的胁迫，如发酵过程的乙醇胁迫等。

处理后的培养物中可以保留酵母培养物中微生物疫苗也可以于3000r/min，5min条件下离心，弃掉上清液，更换新的悬浮溶液进行发酵等细胞后续功能。

本发明第二个目的是请求保护脂多糖在酿酒酵母溶剂胁迫耐受性中的应用。

作为本发明优选的实施例，所述溶剂为乙醇或正丁醇。

本发明第三个目的是请求保护脂多糖在提高酿酒酵母发酵性能中的应用。

本发明的有益效果是：通过本发明采用的微生物疫苗处理细胞方法，可以在超高浓度批次发酵过程中在不降低乙醇得率的情况下缩短发酵时间，并显著提高酿酒酵母暴露于乙醇、正丁醇等胁迫因子下的存活率和细胞活性。

附图说明

图1为本发明实施例1加入不同剂量微生物疫苗后酿酒酵母乙醇胁迫耐受性比较；

图2为为本发明实施例1加入不同剂量微生物疫苗后酿酒酵母正丁醇胁迫耐受性比较；

图3为本发明实施例1加入不同剂量微生物疫苗实验室单倍体酿酒酵母乙醇胁迫耐受性比较；

图4为本发明实施例1加入不同剂量微生物疫苗实验室单倍体酿酒酵母正丁醇胁迫耐受性比较；

图5为本发明实施例2加入微生物疫苗后酿酒酵母发酵过程残糖变化；

图6为本发明实施例2加入微生物疫苗后酿酒酵母发酵过程乙醇积累情况。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不以任何形式受限于实施例内容。实施例中所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法；如无特殊说明，所述试剂和生物材料，均可从商业途径获得。

微生物疫苗可以选用脂多糖，选择市售标准品或由革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)自行制备纯化均可。自行制备可以采用本领域常用的三氯醋酸法、酚水法、水丁醇法等。以常用的酚水法为例：

(1)微生物疫苗的制备

将大肠杆菌菌株活化后转接至营养肉汤培养基，37℃下摇床培养到对数生长期收集菌体，3500r/min离心15min，用4倍体积生理盐水洗剂2次，蒸馏水洗剂1次，用无热原水按1:3比例(每1g湿菌体悬浮于3ml无热原水中)悬浮。菌悬液反复冻融三次后，与等量90wt％苯酚共同加热至68℃后混合，剧烈搅拌30min后，冰浴至2℃离心(4℃，3000×g，20min)。酚相加等体积无热原水重复洗涤2次，收集水相溶液装于透析袋中，流水透析12h去酚，再用蒸馏水透析60h(FeCl₃检测无紫色出现为止)，可用50wt％聚乙二醇6000浓缩至1/4，即得LPS粗品。浓缩后粗LPS中加DNase和RNase各50μg/ml，37℃下酶解4h，100℃水浴加热10min，冷却至室温后离心(1500r/min，30min)，弃沉淀，于上清中加2倍体积丙酮，沉淀后既可获得纯化LPS。纯化后的LPS可用鲎试剂法来检测浓度(EU)。

(2)微生物疫苗作用

微生物疫苗提高酿酒酵母溶剂胁迫耐受性：

取处于对数生长期后期到稳定期前期的工业酵母菌Sc4126、实验室单倍体酵母S288c过夜培养物，3000r/min离心5min，弃上清，用0.1mol/L的pH5.0的柠檬酸三钠缓冲液洗涤两次，最后加缓冲液OD₆₀₀为2.0左右。将脂多糖配制成3EU/mL浓度溶液，分别向酵母培养物中加入不同剂量(0.001EU、0.01EU、0.1EU、1EU)的脂多糖30℃处理细胞1h，然后离心去掉保护剂脂多糖，用柠檬酸三钠缓冲液重悬细胞，使酵母菌分别暴露于不同胁迫条件。对于Sc4126，乙醇/丁醇胁迫模型为25％(v/v)的无水乙醇处理2h，或3％正丁醇冲击45min；对于Sc288c，乙醇/丁醇胁迫模型为25％(v/v)的无水乙醇处理1.5h，或2％正丁醇冲击45min。之后采用美蓝染色后显微镜下拍照计数，蓝色细胞为死亡细胞从而计数确定细胞致死率。

实验结果如图1-4所示。各组微生物疫苗的浓度从0.001EU到1EU，可以看到仅少量脂多糖0.001EU即可起作用，且存在剂量效应。总体微生物疫苗的保护作用对于工业酵母略强于实验室单倍体酵母。

实施例2

微生物疫苗提高工业酿酒酵母的发酵性能：

本实施例考察微生物疫苗在提高工业酿酒酵母的发酵性能中的应用。取对数生长期的酿酒酵母Sc4126，1％(v/v)接种于高糖发酵培养基(260g/L葡萄糖，8g/L蛋白胨，6g/L酵母粉)，添加终浓度为0.002EU/mL的LPS。未加LPS组为阴性对照。实验结果见图5、图6。将实验组与对照组于30℃、150rpm发酵48h，每隔6-12h测定残糖和乙醇。同一实验重复3次以上，进行3批以上发酵，在不同批次间发酵终点时间加微生物疫苗组较阴性对照缩短2-6小时，且终点乙醇得率各组基本持平，均高于0.46g/g左右。