本发明涉及一种发酵法制氢技术领域，尤其涉及一种暗-光发酵耦合生物制氢工艺。
背景技术：
暗发酵细菌能够将大分子有机物分解成小分子有机酸和醇以获得维持自身生长所需的能量和还原力，以解除电子积累而快速释放部分氢气。在产生的小分子有机酸中，只有甲酸可进一步分解释放H2和CO2，其它有机酸因不能被暗发酵细菌继续分解而大量积累，导致暗发酵细菌产氢效率低下，成为暗发酵细菌产氢大规模应用面临的瓶颈问题。而光发酵细菌能够利用暗发酵产生的小分子有机酸并释放氢气。同时光发酵细菌不能直接利用纤维素和淀粉等大分子的复杂有机物，对廉价的废弃的有机资源的直接利用能力和产氢能力较差。所以，充分结合暗光发酵两种细菌各自的优势，将二者耦合到一起形成一个高效产氢体系，不仅可以减少光能需求，而且可以提高体系的产氢效率，同时还可扩大底物的利用范围。
厌氧暗发酵产氢细菌和光发酵产氢细菌联合起来组成的产氢系统称为暗-光耦合产氢途径，它包括两步法和混合培养产氢两种方法。混合培养产氢过程是暗-光发酵细菌在一个培养体系中进行培养产氢，多种微生物组建形成微生物生态协同产氢体系，由于两种细菌各自需要不同的环境，而且暗发酵细菌的生长速率远远大于光发酵细菌，产生的挥发酸的速率远大于光发酵细菌对挥发酸的利用速率，使体系pH急剧下降，严重抑制光发酵细菌的生长，产氢效率降低，所以混合培养产氢尽管工艺简单但较难实现。两步法产氢过程分为两个不同的阶段，第一阶段是大分子有机物的暗发酵过程，产生小分子有机酸同时释放氢气，第二阶段是光发酵细菌利用暗发酵过程产生的小分子有机酸作为电子供体，在固氮酶的催化下的光发酵过程，同时产生氢气，两阶段耦合可以显著改善总氢气量。
研究表明乙酸是暗发酵产氢的主要抑制产物，10mmol/L的乙酸导致产氢量下降21.7％，最大产氢速率下降27.2％；作为光发酵产氢的最佳底物，在连续流培养产氢过程中最适的乙酸钠浓度是32.5mmol/l(2.665g/l)，而且高浓度的乙酸对光发酵细菌的产氢和生长没有毒害作用。因此解决暗发酵产物抑制和满足光发酵最佳底物浓度的矛盾是协调暗-光耦合产氢的一个关键技术问题。另一方面，暗发酵出水中的NH4+抑制固氮酶基因的表达活性，进而对光发酵产氢产生极大的抑制。因此将暗发酵系统中乙酸从发酵液中定向抽提浓缩供给光发酵系统，不仅能够解除暗发酵系统的产物抑制，稳定系统pH，而且为光发酵系统提供最佳底物并消除NH4+抑制，进一步提高两步法耦合产氢效率。
两步法耦合产氢是暗发酵细菌在厌氧条件下发酵有机物产氢；将暗发酵末端产物经过处理，调节到光合细菌适宜条件进行光发酵。光合细菌和暗发酵细菌在各自的最适条件下产氢，产氢效率高。然而，在连续生产过程中暗发酵阶段发酵产物抑制显著，导致底物利用率低，而且需要对暗发酵出水进行离心、过滤等复杂的处理，添加化学药剂，二次灭菌才能调节到光合细菌最适条件，增加了占地面积和处理步骤，极大地限制了耦合生物氢的规模化生产。
技术实现要素：
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种暗-光发酵耦合生物制氢工艺。
本发明的技术方案如下：
一种暗-光发酵耦合生物制氢工艺，包括以下步骤:
A、向暗发酵反应器和光发酵反应器中分别加入培养基，分别使用氮气和氩气向暗发酵反应器和光发酵反应器内曝气，排除反应器中的空气，再加盖密封保持厌氧环境；
B、向暗发酵反应器的培养基中接种暗发酵细菌；
C、向光发酵反应器的培养基中接种光发酵细菌，开启光照系统；
D、将暗—光发酵耦合生物制氢系统置于温度为33～35℃的恒温室内；
E、当暗发酵反应器内pH下降至4.3～4.6时，在双极膜电渗析器两电极间加载直流电源，暗发酵反应器出水经电渗析分离室后，返回暗发酵反应器，电渗析浓缩室产生的浓缩液作为光发酵反应器进水；
F、当暗发酵反应器内pH值上升至4.8～5.0时关闭电源停止电渗析；
G、通过暗发酵气体流量计和光发酵气体流量计检测产氢量，连续培养完成生物制氢。
因为电渗析操作是以乙酸浓度为标准，而本发明研究表明pH与暗发酵液里乙酸的浓度呈指数相关关系，所以本发明用pH来指示暗发酵反应器中的发酵状态。
优选的，所述的步骤A中曝气时间为8～15min，进一步优选为10min。
优选的，所述的步骤B和C中的暗发酵细菌和光发酵细菌的接种体积比均为8～12％，进一步优选的为10％。
优选的，所述的步骤C中的光照系统的光强为120～165w/m2，进一步优选为150w/m2。
本发明的一种暗-光发酵耦合生物制氢工艺，采用了特制的暗-光发酵耦合生物制氢装置，所述的暗-光发酵耦合生物制氢装置包括暗发酵反应器、两室型双极膜电渗析装置和光发酵反应器。其中暗发酵反应器上设置有暗发酵气体流量计，在光发酵反应器上设置有光照系统和光发酵气体流量计，双极膜电渗析装置，其构型和工作方式参见“应用双极膜电渗析技术分离生物制氢发酵液中乙酸的方法”(ZL 200910071848.2)。
本发明的暗-光发酵耦合生物制氢工艺具有如下优点：
1、双极膜电渗析操作可连续进行，也可间歇进行，以暗发酵反应器内的pH值作为控制双极膜电渗析操作的指标。暗发酵反应器内pH下降至4.3～4.6时，打开直流电源启动双极膜电渗析器，当暗发酵反应器内pH值上升至4.8～5.0时，关闭电源停止电渗析。
2、以双极膜电渗析方法分离暗发酵的发酵液，为光发酵定向提供浓缩后浓度20～30mmol/L的乙酸。
3、以双极膜电渗析方法回收暗发酵发酵液中的葡萄糖和NH4+，提高底物利用率。
4、浓缩乙酸不需要过滤、灭菌等处理即可作为光发酵进水。
综上所述：本发明提出一种暗—光发酵耦合生物制氢工艺，在暗发酵反应器后加入双极膜电渗析单元，对暗发酵出水组分进行分离，得到浓缩的乙酸，经pH调节后作为光发酵反应器的进水，同时回收未被利用的底物返回暗发酵反应器再利用。
本发明能够解除暗发酵产氢段的产物抑制，控制发酵系统pH在最佳范围，有效回收底物再利用提高底物总体利用率，并为光发酵产氢段提供最佳底物——乙酸，去除暗发酵出水中的NH4+，进而解除对光发酵细菌固氮酶的抑制，同时完成对暗发酵细菌的截留分离，替代原有工艺的离心过滤灭菌等过程。分别为暗发酵和光发酵阶段提供最适产氢条件，提高暗发酵细菌和光发酵细菌两步法耦合产氢效率。
附图说明
图1为本发明的暗-光发酵耦合生物制氢装置整体结构示意图，1—暗发酵反应器，2—暗发酵细菌，3—两室型双极膜电渗析器，4—光发酵反应器，5—光发酵细菌，6—光照系统，7—阴离子交换膜，8—双极膜，9—暗发酵气体流量计，10—光发酵气体流量计，11—电极，12—分离室，13—浓缩室。
具体实施方式
实施例1
一种暗-光发酵耦合生物制氢工艺，包括以下步骤:
A、向暗发酵反应器和光发酵反应器中分别加入培养基，分别使用氮气和氩气向暗发酵反应器和光发酵反应器内曝气10min排除反应器中的空气，再加盖密封保持厌氧环境；
B、向暗发酵反应器的培养基中按接种体积比为10％接入暗发酵细菌；
C、向光发酵反应器的培养基中按接种体积比为10％接入光发酵细菌，控制光照系统的光强至150w/m2；
D、将暗—光发酵耦合生物制氢系统置于温度为33～35℃的恒温室内；
E、当暗发酵反应器内pH下降至4.3～4.6时，在双极膜电渗析器两电极间加载直流电源，暗发酵反应器出水经电渗析分离室后，返回暗发酵反应器，电渗析浓缩室产生的浓缩液作为光发酵反应器进水；
F、当暗发酵反应器内pH值上升至4.8～5.0时关闭电源停止电渗析；
G、通过暗发酵气体流量计和光发酵气体流量计检测产氢量，连续培养完成生物制氢。
所述的步骤A中曝气时间为8～15min，进一步优选为10min。
本实施例中暗发酵培养基由葡萄糖10g，蛋白胨4g，牛肉膏2g，酵母汁1g，K2HPO41.5g，NaCl 4g，FeSO4·7H2O 0.08g，MgC1·6H2O 0.1g，L-半胱氨酸0.5g，0.5ml 0.2％的刃天青，微量元素液1ml，维生素液1ml和1L蒸馏水组成，其中微量元素液成分：四水氯化锰0.05mg，五水硫酸铜0.05g，六水氯化铁5mg，六水硝酸钴0.5mg，七水硫酸锌1mg，硼酸1mg，蒸馏水1L；维生素液成分：烟酸0.35g，生物素0.1g，盐酸硫胺素0.3g，泛酸钙0.1g，对氨基苯甲酸0.2g，维生素B120.05g，盐酸吡哆铵0.1g，蒸馏水1.0L。
本实施例中光发酵培养基：乙酸钠1g，琥珀酸钠1g,氯化铵1g，牛肉膏1g,蛋白胨0.5g,氯化钠0.2g，七水硫酸镁0.2g，碳酸氢钠1.0g，无水氯化钙0.08g，微量元素液1ml，磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，L-半胱氨酸0.5g，微量元素液1ml，维生素液1ml，蒸馏水1L，pH 7.0。
暗发酵反应器的工作体积为1200mL，光发酵反应器的工作体积为2000ml，光照系统采用白炽灯光照，反应器表面光照强度为150W/m2。
双极膜电渗析装置为二室式电渗析器，电极采用钛镀钌电极板(规格100×100×2mm)；电极与膜的间距为0.5cm、膜间距为3cm、单膜面积为100cm2。双极膜和阴离子交换膜均来自分离室和浓缩室的容积均为300mL，两极室连通，极水为5％的Na2SO4。
暗发酵反应区的培养基中接入的暗发酵细菌为哈工大产乙醇杆菌B49(Ethanologen bacterium hit B49)，它的保藏编号为CGMCC No.1153，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，它为购买得到，它的发酵类型为乙醇型发酵。光发酵反应区的培养基中接入的光发酵细菌为专利公开号为CN102816797A，“一种增强光发酵细菌粪红假单胞菌絮凝性能的方法”中所使用的粪红假单胞(Rhodopseudomonas faecalis)RLD-53。
对实施例1中的产氢量进行测试，得到如下数据：暗发酵反应器中的暗发酵细菌产氢量为2640.83ml H2/L工作体积，光发酵反应器中的光发酵细菌产氢量为2317.77ml H2/L工作体积，暗—光发酵耦合生物制氢工艺的比产氢率为4.18mol H2/mol葡萄糖。
实施例2
一种暗-光发酵耦合生物制氢工艺，包括以下步骤:
A、向暗发酵反应器和光发酵反应器中分别加入培养基，分别使用氮气和氩气向暗发酵反应器和光发酵反应器内曝气9min排除反应器中的空气，再加盖密封保持厌氧环境；
B、向暗发酵反应器的培养基中按接种体积比为12％接入暗发酵细菌；
C、向光发酵反应器的培养基中按接种体积比为12％接入光发酵细菌，控制光照系统的光强至120w/m2；
D、将暗—光发酵耦合生物制氢系统置于温度为33～35℃的恒温室内；
E、当暗发酵反应器内pH下降至4.3～4.6时，在双极膜电渗析器两电极间加载直流电源，暗发酵反应器出水经电渗析分离室后，返回暗发酵反应器，电渗析浓缩室产生的浓缩液作为光发酵反应器进水；
F、当暗发酵反应器内pH值上升至4.8～5.0时关闭电源停止电渗析；
G、通过暗发酵气体流量计和光发酵气体流量计检测产氢量，连续培养完成生物制氢。
实施例3
一种暗-光发酵耦合生物制氢工艺，包括以下步骤:
A、向暗发酵反应器和光发酵反应器中分别加入培养基，分别使用氮气和氩气向暗发酵反应器和光发酵反应器内曝气15min排除反应器中的空气，再加盖密封保持厌氧环境；
B、向暗发酵反应器的培养基中按接种体积比为8％接入暗发酵细菌；
C、向光发酵反应器的培养基中按接种体积比为8％接入光发酵细菌，控制光照系统的光强至165w/m2；
D、将暗—光发酵耦合生物制氢系统置于温度为33～35℃的恒温室内；
E、当暗发酵反应器内pH下降至4.3～4.6时，在双极膜电渗析器两电极间加载直流电源，暗发酵反应器出水经电渗析分离室后，返回暗发酵反应器，电渗析浓缩室产生的浓缩液作为光发酵反应器进水；
F、当暗发酵反应器内pH值上升至4.8～5.0时关闭电源停止电渗析；
G、通过暗发酵气体流量计和光发酵气体流量计检测产氢量，连续培养完成生物制氢。
实施例4
一种暗-光发酵耦合生物制氢工艺，包括以下步骤:
A、向暗发酵反应器和光发酵反应器中分别加入培养基，分别使用氮气和氩气向暗发酵反应器和光发酵反应器内曝气8min排除反应器中的空气，再加盖密封保持厌氧环境；
B、向暗发酵反应器的培养基中按接种体积比为12％接入暗发酵细菌；
C、向光发酵反应器的培养基中按接种体积比为10％接入光发酵细菌，控制光照系统的光强至150w/m2；
D、将暗—光发酵耦合生物制氢系统置于温度为33～35℃的恒温室内；
E、当暗发酵反应器内pH下降至4.3～4.6时，在双极膜电渗析器两电极间加载直流电源，暗发酵反应器出水经电渗析分离室后，返回暗发酵反应器，电渗析浓缩室产生的浓缩液作为光发酵反应器进水；
F、当暗发酵反应器内pH值上升至4.8～5.0时关闭电源停止电渗析；
G、通过暗发酵气体流量计和光发酵气体流量计检测产氢量，连续培养完成生物制氢。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。