本发明涉及一种双顺反子表达载体，同时还涉及包含该表达载体的真核细胞表达系统、制备方法及应用，属于基因工程
技术领域：
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背景技术：
：：生物制药是21世纪的高科技产业，其中治疗性重组蛋白的是生物制药的一个重要部分，目前在全世界的年产值(包括重组抗体)突破1千多亿美元。众多周知，原核及低等真核生物缺乏复杂的翻译后修饰功能，因此相关治疗性重组蛋白需要在高等真核细胞中表达以具备活性，而这其中近70％采用中国仓鼠卵巢(Chinesehamsterovary，CHO)细胞表达系统。但是CHO细胞表达系统也存在目的蛋白表达水平低、高产稳定细胞筛选周期长、细胞培养成本高等缺陷，这严重制约着重组蛋白药物的生产。而影响重组蛋白在CHO细胞中表达的因素众多，表达载体就是其中一个重要因素。此外，在CHO细胞表达系统中，高水平持续稳定表达的细胞株往往难以得到，这是因为转基因转染细胞后的随机整合，使有些转基因发生沉默或者表达水平降低，因此需要从大量细胞克隆株中分离出稳定高效表达的克隆细胞株，这也给基因工程产业化生产带来了很大困扰(Astudyofmonoclonalantibody-producingCHOcelllines:whatmakesastablehighproducer？Biotechnol.Bioeng.2009)。核基质结合区序列(matrixattachmentregion，MAR)是限制酶消化后仍附着在核基质上的DNA序列，长度为300～3000bp，富含AT碱基对(＞60％)，以及几个短的“共有序列”，如A-box(AATAAAYAAA)、T-box(TTWTWTTWTT)、DNA链解旋序列(AATATATTT或AATATT)、拓扑异构酶II结合位点(GTNWAYATTNATNNR)等。研究表明，MAR序列能提高CHO表达系统转基因表达水平，同时降低转化株转基因表达水平差异(Genome-widepredictionofmatrixattachmentregionsthatincreasegeneexpressioninmammaliancells.Nat.Methods.2007；PositionaleffectsofthematrixattachmentregionontransgeneexpressioninstablytransfectedCHOcells.CellBiol.Int.2010)。已有研究证明，MAR提高转基因表达与载体上的其他调控原件(regulatoryelements)有关，如MAR与不同启动子组合对提高重组蛋白的表达水平不一等(ImpactofUsingDifferentPromotersandMatrixAttachmentRegionsonRecombinantProteinExpressionLevelandStabilityinStablyTransfectedCHOCells.MolBiotechnol.2014)。调控原件如选择标记(selectionmarker)、内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite，IRES)等对转基因的表达也有不同作用(ImprovedrecombinantproteinyieldusingacodondeoptimizedDHFRselectablemarkerinaCHEF1expressionplasmid.BiotechnolProg.2010；IRES-mediatedTricistronicvectorsforenhancinggenerationofhighmonoclonalantibodyexpressingCHOcelllines.JBiotechnol.2012)。技术实现要素：本发明的目的是提供一种双顺反子表达载体，该载体能同时表达目的基因和标记基因，提高阳性细胞克隆筛选率，同时载体上包含MAR序列，能克服转基因沉默，提高目的蛋白表达水平，以及后续单克隆细胞株筛选的有效性。同时，本发明还提供一种双顺反子表达载体的制备方法。最后，本发明再提供一种包含上述表达载体的真核细胞表达系统、制备方法及应用。为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：双顺反子表达载体，包含在启动子上游和PolyA下游插入的核基质结合区序列(matrixattachmentregion，MAR)，以及IRES序列(internalribosomeentrysite，内核糖体进入位点序列)和筛选标记基因。通过在启动子与IRES序列之间插入目的基因，可构成目的基因-IRES序列-筛选标记基因依次连接的双顺反子序列。表达载体的结构为：MAR-启动子-目的基因-IRES序列-筛选标记基因-PolyA-MAR。所述启动子选自SV40、CMV、EF-1α、CAG等中的任意一种。优选为CMV启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。所述核基质结合区序列选自β-珠蛋白MAR序列(GenBank：L22754.1，第840～2998位碱基)、X-29序列(GenBank：EF694970.1，第1～3337位碱基)、β-干扰素MAR序列(GenBank：M83137.1，第1～2201位碱基)、MAR1-68(GenBank：EF694965.1，第1～3614位碱基)等中的任意一种。优选为β-珠蛋白MAR序列。所述IRES序列选自Immunoglobulinheavychainbindingprotein(BIP)(NCBIReferenceSequence：NM_005347.4，第40～407位碱基)、Humanrhinovirus(HRV)(NCBIReferenceSequence：NC_001617.1，第1～621位碱基)、Apoptoticprotease-activatingfactor1(Apaf-1)(NCBIReferenceSequence：NM_013229.2，第1～580位碱基)等中的任意一种。优选为HRVIRES序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。所述筛选标记基因选自新霉素磷酸转移酶(neomycinphosphotransferase，NPT)、博来霉素(zeocin/zeomycin)抗性基因等中的任意一种。优选为NPT抗性弱化基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。优选的，双顺反子表达载体具体采用CMV启动子，核基质结合区序列为β-珠蛋白MAR序列，IRES序列为HRVIRES序列，筛选标记基因为NPT抗性弱化基因。双顺反子表达载体可采用常规方法制备。以上优选基因序列的表达载体的制备，具体包括以下步骤：1)分别采用NsiI和XmaI酶双酶切SEQIDNO:4所示序列和pIRES-Neo载体，回收酶切片段，连接、转化后鉴定，得到pIRES-C1载体；2)分别采用XmaI和XbaI酶双酶切SEQIDNO:5所示序列和pIRES-C1载体，回收酶切片段，连接、转化后鉴定，得到pIRES-C2载体；3)分别在pIRES-C2载体上CMV启动子的NruI、MluI酶切位点之间以及polyA下游的XhoI、BstZ17I酶切位点之间插入β-珠蛋白MAR序列，即得。真核细胞表达系统，包含上述双顺反子表达载体。真核细胞表达系统的制备，包括以下步骤：1)将目的基因插入双顺反子表达载体的启动子与IRES序列之间，构建得到重组表达载体；2)将重组表达载体转染进入宿主细胞，经筛选得到表达系统。步骤2)中宿主细胞选自DG44、DXB11、CHO-K1、CHO-S等中的任意一种。优选为CHO-S细胞。步骤2)中转染的方法包括磷酸钙法、电转法、脂质体转染法等，优选为电转法。上述双顺反子表达载体、真核细胞表达系统在制备包含目的蛋白的药物中的应用。本发明的有益效果：本发明中双顺反子表达载体包含核基质结合区序列、内核糖体进入位点序列和筛选标记基因，通过在启动子与IRES序列之间插入目的基因，可构成目的基因-IRES序列-筛选标记基因依次连接的双顺反子序列。表达载体的结构为：MAR-启动子-目的基因-IRES序列-筛选标记基因-PolyA-MAR。该载体利用一个启动子实现目的基因和筛选标记的同时表达，可减少由于不同表达框存在导致的假阳性细胞克隆，提高阳性细胞克隆筛选率，并克服传统载体目的基因与筛选标记基因表达不均衡的问题。同时载体上包含MAR序列，能克服转基因沉默，实现转基因在宿主细胞中的高效、长期表达。采用优化序列构建的双顺反子表达载体可显著弱化下游筛选标记的表达，更易于获得高表达目的蛋白的细胞克隆，同时提高后续单克隆细胞株筛选的有效性。附图说明图1为实施例1中pIRES-Neo载体的结构示意图；图2为pIRES-C1载体的结构示意图；图3为pIRES-C2载体的结构示意图；图4为pIRES-C3载体的结构示意图；图5为EPO在CHO-S细胞中的表达水平；图6为EPO在不同载体下筛选的单细胞克隆的表达水平比较；图7为EPO在不同载体下的平均表达水平比较；图8为EPO在不同载体下的阳性克隆率比较。具体实施方式下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。除所列举的实施例外，还可以有其他的实施方式，但是凡采用等同替换或等效变换获得的技术方案，均落在本发明要求的保护范围内。实施例1双顺反子表达载体的构建，具体步骤如下：1、pIRES-C1载体的构建(替换pIRES-Neo载体上的IRES序列)1)合成IRES序列设计并人工合成IRES序列(如SEQIDNO:4所示)，具体交由通用生物基因(安徽)有限公司完成。为便于克隆及保证序列完整性，合成IRES序列时，5'端引入AGCATGCATCTAGGGCGGCCA序列，其中AGC为保护碱基，ATGCAT为NsiI酶切位点，CTAGGGCGGCCA序列为载体pIRES-Neo上的部分序列(GenBank：U89673.1，第1283～1294位碱基)；3′端引入CCCCGGGATA(Genbank：U89673.1，第1885～1894位碱基)，其中ATA为酶切保护碱基，CCCGGG为XmaI酶切位点。2)构建pIRES-C1载体用NsiI/XmaI双酶切合成的IRES序列，同时用NsiI/XmaI双酶切pIRES-Neo质粒DNA(pIRES-Neo质粒结构示意图见图1)。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的IRES序列片段和pIRES-Neo线性质粒DNA。合成IRES序列的双酶切体系为：合成IRES序列10μL(1μg/μL)，10×NEBuffer2.13μL，NsiI/XmaI(10U/μL)各1.0μL，补足水至30μL，酶切条件为：37℃，酶切3min。pIRES-Neo质粒的双酶切体系为：pIRES-Neo质粒5μL(1μg/μL)，10×NEBuffer2.12μL，NsiI/I/XmaI(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。取酶切后的IRES序列片段和pIRES-Neo线性质粒DNA(摩尔比5:1)，使用NEB公司TM的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到E.coliJM109菌株感受态细胞悬液中转化，取150μL转化菌液接种到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养。提取重组质粒进行双酶切(NsiI/I/XmaI)验证，验证正确的质粒进行测序验证，构建正确的质粒命名为pIRES-C1(结构示意图见图2)。2、pIRES-C2载体的构建(替换pIRES-C1载体上的筛选标记为NPT抗性弱化基因)1)合成NPT抗性弱化基因设计并人工合成NPT抗性弱化基因(如SEQIDNO:5所示)，具体交由通用生物基因(安徽)有限公司完成。为便于克隆及保证序列完整性，合成NPT抗性弱化基因时，5′端引入AACCCCGGGATAATTCCTGCAGCCAAT序列，其中AAC为保护碱基，CCCGGG为XmaI酶切位点，ATAATTCCTGCAGCCAAT为载体pIRES-Neo上的部分序列(GenBank：U89673.1，第1892～1909位碱基)；3′端引入GGGGATCAATTCTCTAGAGCT序列，其中GCT为保护碱基，TCTAGA为XbaI酶切位点，GGGGATCAATTC为载体pIRES-Neo上的部分序列(GenBank：U89673.1，第2714～2725位碱基)。2)构建pIRES-C2载体用XmaI/XbaI双酶切合成的NPT抗性弱化基因，同时用XmaI/XbaI双酶切pIRES-C1质粒DNA，再用NEB公司TM的连接试剂盒25℃连接5min，酶切、连接的体系及条件基本同步骤1)。将连接产物加入到E.coliJM109菌株感受态细胞悬液中转化，取150μL转化菌液接种到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养。提取重组质粒并进行双酶切(XmaI/XbaI)验证，取酶切验证正确的质粒进行测序验证，构建正确的质粒命名为pIRES-C2(结构示意图见图3)。3、pIRES-C3载体的构建(在pIRES-C2载体的启动子CMV的上游及polyA的下游插入β-珠蛋白MAR序列)1)合成β-珠蛋白MAR序列根据β-珠蛋白MAR序列(GenBank：L22754.1，第840～2998位)设计引物P1、P2、P3、P4。在引物P1、P2的5′端分别引入NruI、MluI酶切位点，P3、P4的5′端分别引入XhoI、BstZ17I酶切位点，引物序列如下(下划线为酶切位点)：P1：5′-GTCTCGCGAAATATATCTCCTGATAAAATGTCTA-3′；P2：5′-AGCACGCGTGGATCCTCCCATTTCGGCCTCCTG-3′；P3：5′-GTCCTCGAGAATATATCTCCTGATAAAATGTCTA-3′；P4：5′-GTCGTATACGGATCCTCCCATTTCGGCCTCCTG-3′。提取人外周血基因组DNA作为模板，分别用引物P1/P2、P3/P4进行PCR扩增，扩增反应体系见下表1。表1PCR扩增反应体系PCR扩增程序为：95℃3min，94℃40s，58℃30s，72℃40s，每个退火温度4个循环，最后55℃，30个循环，72℃3min。琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物，送生物公司测序验证。结果表明，两个体系扩增出的DNA片段均与GenBank登录的β-珠蛋白MAR序列一致。2)构建启动子CMV上游含β-珠蛋白MAR序列的表达载体用NruI/MluI双酶切引物P1/P2扩增出的β-珠蛋白MAR序列，同时用NruI/MluI双酶切pIRES-C2质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的β-珠蛋白MAR序列片段和pIRES-C2线性质粒DNA。β-珠蛋白MAR序列的双酶切体系为：β-珠蛋白MAR序列10μL(1μg/μL)，10×NEBuffer3.13μL，NruI/MluI(10U/μL)各1.0μL，补足水至30μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。pIRES-C2质粒的双酶切体系为：pIRES-C2质粒5μL(1μg/μL)，10×NEBuffer3.12μL，NruI/MluI(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。取酶切后的β-珠蛋白MAR序列片段和pIRES-C2线性质粒DNA(摩尔比5:1)，使用NEB公司TM的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到E.coliJM109菌株感受态细胞悬液中转化，取150μL转化菌液接种到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养。提取重组质粒并进行双酶切(NruI/MluI)验证，取酶切验证正确的质粒进行测序验证，构建正确的质粒命名为pIRES-C3M。3)构建启动子CMV上游及polyA下游均含β-珠蛋白MAR序列的表达载体用XhoI/BstZ17I双酶切P3/P4扩增出的β-珠蛋白MAR序列，同时用XhoI/BstZ17I双酶切pIRES-C3M质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的β-珠蛋白MAR序列片段和pIRES-C3M线性质粒DNA。使用NEB公司TM的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到E.coliJM109菌株感受态细胞悬液中转化，取150μL转化菌液接种到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养。提取重组质粒并进行双酶切(XhoI/BstZ17I)验证，取酶切验证正确的质粒进行测序验证，构建正确的质粒命名为pIRES-C3(结构示意图见图4)。实施例2真核细胞表达系统的构建，具体步骤如下：1、构建含EPO外源基因的双顺反子表达载体1)合成EPO序列根据NCBI公布的EPO序列(GenBank：JN849371.1，第1～582位碱基)，人工合成EPO序列(5′端和3′端分别引入EcoRI、BamHI酶切位点)，具体交由通用生物基因(安徽)有限公司完成。2)构建含EPO序列的双顺反子表达载体用EcoRI/BamHI双酶切引物人工合成的EOP序列，同时用EcoRI/BamHI双酶切pIRES-C3质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的EPO序列片段和pIRES-C3线性质粒DNA。EPO序列的双酶切体系为：EPO序列片段10μL(1μg/μL)，10×NEBuffer2.13μL，EcoRI/BamHI酶(10U/μL)各1.0μL，补足水至30μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。pIRES-C3质粒的双酶切体系为：：pIRES-C3质粒5μL(1μg/μL)，10×NEBuffer2.12μL，EcoRI/BamHI(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。取酶切后的EPO序列片段和pIRES-C3线性质粒DNA(摩尔比5:1)，使用NEB公司TM的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到E.coliJM109菌株感受态细胞悬液中转化，取150μL转化菌液接种到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养。提取重组质粒并进行双酶切(EcoRI/BamHI)验证，取酶切验证正确的质粒进行测序验证，构建正确的质粒命名为pIRES-C3-EPO。2、构建真核细胞表达系统选择生长状态良好的CHO-S细胞接种到6孔培养板上，待铺板密度达到约80％进行转染。具体操作步骤如下：10μLlipofectamine2000+240μL无血清Opti-MEM培养基，在37℃孵箱中静置5min，将无血清Opti-MEM培养基与250μL(5μg)表达载体pIRES-C3-EPO混合，37℃孵箱中静置20min；同时用PBS将6孔培养板上的细胞清洗三遍，加入2mL无血清的DMEM细胞培养基；然后将脂质体与含pIRES-C3-EPO质粒DNA的混合液逐滴轻滴入孔中，尽快轻轻摇晃培养平板使其混匀；放入5％CO2细胞培养箱中，37℃培养6h后，将无血清DMEM培养基更换成DMEM完全培养基，放入细胞培养箱内继续培养。48h后在转染孔中加入600μg/mL的G418药物，每48h换成新鲜D/F完整培养基，从第五天开始细胞大量死亡。筛选两周后将G418浓度调整到维持浓度300μg/mL继续培养。药物筛选完成后，对细胞进行有限稀释法单克隆化操作。约两个星期单克隆细胞在孔中长至80％，一天后取细胞上清做ELISA检测，检测结果见图5。由图5可知，挑选的10个克隆中，2#和6#克隆的产率最佳，分别为123.2mg/L和136.3mg/L。试验例参照实施例2中方法构建含EPO外源基因的pIRES-Neo-EPO表达载体，经同一操作后获得数量近似的单克隆细胞株，对阳性单克隆群进行ELISA检测，并比较克隆株的表达量，各自筛选得到十个稳定细胞株，对10株细胞的EPO表达量进行分析，结果显示，利用本发明表达系统的EPO表达水平明显高于传统的表达系统，pIRES-C3-EPO表达载体转染的CHO-S细胞的EPO表达量平均为105.12mg/L，而传统表达系统的EPO表达量仅为29.35mg/L(见图6和图7)。此外，本发明表达系统的阳性克隆率为71.74％，而传统表达系统的阳性克隆率为13.7％，即假阳性率显著低于传统的表达系统(P＜0.05)(见图8)。实施例及试验例中所用大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109、pIRES-Neo质粒载体、细胞系试剂、工具酶等均为市售商品。内切酶及NEBuffer均购自美国NewEnglandBiolabsLTD(NEB)，pIRES-Neo质粒载体购自Clontech生物公司。<110>新乡医学院<120>双顺反子表达载体、表达系统、制备方法及应用<170>PatentInversion3.5<211>599<212>DNA<213>序列<221>CMV启动子<222>(1)..(599)<400>1agatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtca60ttagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcct120ggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagta180acgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccac240ttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggt300aaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcag360tacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaat420gggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaat480gggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgcc540ccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctct599<211>621<212>DNA<213>序列<221>HRVIRES序列<222>(1)..(621)<400>2ttaaaactgggagtgggttgttcccactcactccacccatgcggtgttgtactctgttat60tacggtaactttgtacgccagtttttcccacccttccccataatgtaacttagaagtttg120tacaatatgaccaataggtgacaatcatccagactgtcaaaggtcaagcacttctgtttc180cccggtcaatgaggatatgctttacccaaggcaaaaaccttagagatcgttatccccaca240ctgcctacacagagcccagtaccatttttgatataattgggttggtcgctccctgcaaac300ccagcagtagacctggcagatgaggctggacattccccactggcgacagtggtccagcct360gcgtggctgcctgctcacccttcttgggtgagaagcctaattattgacaaggtgtgaaga420gccgcgtgtgctcagtgtgcttcctccggcccctgaatgtggctaaccttaaccctgcag480ccgttgcccataatccaatgggtttgcggtcgtaatgcgtaagtgcgggatgggaccaac540tactttgggtgtccgtgtttcctgtttttcttttgattgcattttatggtgacaatttat600agtgtatagattgtcatcatg621<211>795<212>DNA<21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