一种dsRNA表达载体及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种dsRNA表达载体及应用。
【背景技术】
[0002] RNAi是指是指外源或内源的双链RNA(dsRNA)所致的细胞内同源祀基因有效的和 特异性的基因封闭。双链RNA所介导的有效的和特异性的基因沉默已在多种无脊椎动物和 脊椎动物中发现和证实，例如线虫、果觸、斑马鱼等。
[0003]RNAi-经发现就成为研究的热点，为研究基因功能、信号传导通路和基因治疗提 供新思路。在医学研究中，肿瘤的RNAi治疗将成为基因治疗的重要部分，dsRNA新型药剂 的开发将成为一项新兴产业。
[0004]RNAi在昆虫中也得到了广泛研究。科学家通过dsRNA的人工导入，有目的地干扰 昆虫体内内源基因的表达，从而根据基因缺失的拟表型确定该基因的功能。近年来，RNAi技 术在导入方法和基因功能分析方面都取得了迅猛发展，且与转基因技术相结合成功应用于 害虫防治领域。目前昆虫RNAi导入方法主要有注射法、喂食法和组织培养法。研究发现， 通过饲喂表达dsRNA的作物或微生物来沉默特定基因进而控制害虫，更有利于RNAi在害虫 防治中的应用，为农业害虫防治领域开辟新的空间。
【发明内容】
[000引本发明的目的是提供一种双链RNA(dsRNA)表达载体及应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明提供的dsRNA表达载体祀T30s，其构建方法如下：
[0007] 1)W祀T30a为骨架载体，采用内切酶甜al和BlpI切除载体中两个酶切位点之间 的片段；
[000引 2)合成W下DNA片段：
[0010] 采用内切酶甜al和BlpI进行双酶切，替换掉祀T30a载体中的相应片段，即构建 得到载体祀T30S。
[0011] 该载体W祀T30a为原始载体，去除了化S-化g、凝血酶酶切位点、S-Tag和肠激酶 酶切位点等区域，增加了反向T7启动子和T7终止子。可运用双酶切和连接技术，将目的基 因连接到载体的表达区域，形成重组表达质粒。
[0012] 优选地，载体祀T30s的全序列如SeqIDNo. 1所示，质粒结构见图1。
[0013] 该载体具有W下特征：
[0014] 1、具有卡郝霉素抗性，便于筛选阳性克隆；
[0015] 2、同时具有正向和反向T7启动子，可W双向转录RNA;
[0016] 3、在正向和反向T7启动子后面都带有乳糖操纵子，可W更精确地双向调节RNA的 转录；
[0017] 4、乳糖操纵子后即为一段多酶切位点区域，其中的酶切位点均是常见的酶切的位 点，操作方便；
[0018] 5、同时具有正向和反向T7终止子，终止多余片段的转录，减少了多余RNA的转录。
[0019] 载体祀T30S的使用方法包括W下步骤：
[0020] (1)引物设计；引物退火温度6(TC左右；引物设计时要带上酶切位点和保护碱基， W便后续与带有相同酶切位点的表达载体祀T30S进行连接。目的基因CDNA序列中一定不 含该酶切位点，且上、下游引物所带2个酶切位点在载体祀T30S上的位置要尽可能远一点； 引物设计时选用的内切酶应该从载体多酶切位点区域中的酶切位点中选定；
[0021] (2)目的基因的克隆；采用高保真酶进行基因扩增，体系和程序参照酶说明书；
[0022] (3)双酶切；用预先设计好的相应内切酶，对祀T30S载体和PCR扩增产物进行双 酶切，反应体系及条件参见内切酶使用说明书。然后回收酶切产物，产物回收方法参见胶回 收试剂盒说明书；
[0023] (4)连接；将双酶切回收的目的基因产物与对应的双酶切祀T30S载体用T4DNA连 接酶连接，连接体系及条件参见使用说明书；
[0024] (5)转化；将连接产物加入到预先制备好的大肠杆菌感受态细胞HT115中，冰浴 SOmin后42°C热激Imin,然后冰浴2min，向感受态细胞中加入500ULLB培养基，37°C、 200巧m摇Ih使细菌复苏；
[00巧](6)将上步菌液1000 g常温离必2min，留取150UL上清涂布于含有卡郝霉素的平 板培养基上（含40yL20mg/mLIPTG)，37°C正置培养1. 5-化，然后倒置培养12~1化至 平板上长出菌落；
[0026] (7)单克隆培养；用牙签小必挑取大小合适的白色单菌落于1. 5血邱pendo计管 (盛有含卡郝霉素的LB液体培养基）中，37 C、200rpm/min摇荡4~化进行扩大培养（直 至菌液浑浊）；
[0027] (8)阳性鉴定：
[002引 PCR反应体系如下：
[0031] PCR反应条件为；94°C预变性3min，94°C 50sec，55°C 50sec，72°C 50sec，34个循 环；72°C延伸 10min，12°C保存；
[0032] 所得PCR产物，经I. 2%琼脂糖电泳检测，若出现相应大小的条带即为阳性；将呈 阳性结果的菌液送公司进行测序，确定表达载体构建成功；
[0033] (9)表达条件的摸索：将12ml卡郝霉素抗性的培养基按1:100的体积比加入菌液 中，进一步培养；当ODe。。= 0. 5~0. 8 (优选0. 6)时吸出1血作对照，然后加入IPTG诱导， 终浓度为lmM，按诱导后l、2、3、4、5、6、8、l化取样，样品-7(rC保存待用。用化izol方法提 取总RNA，经1. 2 %琼脂糖电泳检测。
[0034] 本发明还提供含有所述表达载体祀T30S的宿主细胞。
[0035] 本发明还提供含有所述表达载体祀T30S的工程菌，例如大肠杆菌HT115。
[0036] 本发明还提供表达载体祀T30S在基因沉默中的应用，将目的dsRNA克隆至表达载 体祀T30s中，用重组质粒转化作物或大肠杆菌HTl15,通过饲喂害虫表达目的dsRNA的作物 或大肠杆菌来沉默害虫特定基因的表达。
[0037] 本发明进一步提供表达载体祀T30S在制备基因药物中的应用。
[0038] 本发明涉及一种dsRNA表达载体祀T30S，该载体能够可控制的表达目的dsRNA。目 的基因可连接到祀T30S形成重组质粒，然后将重组质粒转入大肠杆菌内，通过喂食转入该 重组质粒的大肠杆菌，进而将目的dsRNA导入昆虫体内，从而达到研究基因功能和防治害 虫的目的。
[0039] 本发明具有W下优点：
[0040](一）特异性强，载体祀T30S在制备过程中尽可能的去除了表达区域的多余序 列，使得表达产物中非特异序列尽量缩减，在一定程度上减少非目的基因片段造成的脱祀 效应。
[0041](二）可调控性高，载体祀T30S具有正反双向乳糖操纵子，可W有目的地调控载体 表达双链RNA。
[0042] (H)操作简单，载体祀T30S构建过程中涉及到的技术均为传统分子生物学技术， 技术成熟。
[004引（四）使用范围广，几乎可W有目的地表达任意基因的双链RNA。
[0044](五）成本低，本发明中使用的酶均为分子生物学实验过程中常用的酶。
【附图说明】
[0045] 图1为本发明表达载体祀T30s的结构示意图。
[0046] 图2为本发明实施例2中绿色英光蛋白GFP的PCR扩增结果图。
[0047] 图3为本发明实施例2中GFP的PCR扩增产物与祀T30S的双酶切电泳图。
[0048] 图4为本发明实施例2中采用祀T30S插入GFP片段后的总RNA电泳图。
【具体实施方式】
[0049]W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:a1油oratorymanual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件