一种表达载体及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种表达载体，包含至少一个调控单元，其含有增强子和启动子：增强子为hrx增强子或其功能片段或序列变体；启动子为MT启动子或其功能片段或序列变体，或Act5C启动子或其功能片段或序列变体；其中，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强子、Bombyx mori中的hr3增强子，或AcMNPV中的hr3增强子；所述的MT启动子为果蝇细胞金属硫蛋白启动子，其为诱导性启动子，受金属离子诱导；所述的Act5C启动子为果蝇细胞中的Actin 5C启动子。所述表达载体可在果蝇S2细胞高效表达。本发明构建了一个能够在双翅目昆虫果蝇S2细胞上高效表达的含鳞翅目杆病毒基因hr5增强子的重组蛋白表达载体，克服了现有技术中由于种属隔离的原因，杆病毒不在双翅目昆虫中传播的技术偏见。
【专利说明】
一种表达载体及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达载体及其应用。
【背景技术】
[0002] -些培养的昆虫细胞系是各种研究应用以及作为疫苗的病毒类颗粒(VLP)的重组 蛋白异源表达的重要宿主（Cherezov等，2007 ; Imasaki等人，2011;Rasmussen等人，2007; White 等人，2012)，（Metz 和Pi j lman，2011; Shrestha等人，2007;Treanor 等人，2011; Treanor等人，2011年）。这些工艺主要利用杆状病毒表达载体系统(BEVS)来感染源自鳞翅 目的细胞系。（Berger等人，2004; Jarvis，2009 ;Kost等人，2005; Summers，2006) 〇
[0003] 我们发现鳞翅目杆病毒同源区域5(h〇m〇l〇g 〇US region 5)增强子(hr5增强子）用 于鳞翅目昆虫细胞的高效表达载体，可以显著提高鳞翅目昆虫细胞的重组蛋白表达能力。 [0004] 而S2(Drosophila Schneider 2)细胞是一种果绳细胞，属于双翅目果绳科果绳属 的一种昆虫细胞，通常由于种属隔离，应用于不同种属的重组表达载体通常无法通用，杆病 毒是专门针对性的传染鳞翅目昆虫，通常不在双翅目昆虫中传播。即在鳞翅目昆虫细胞中 高效表达的表达载体，无法在双翅目昆虫细胞中有效表达。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种表达载体及其应用，通过构建了一个 在双翅目昆虫果蝇S2细胞上高效表达的含鳞翅目杆病毒基因 hr5增强子的重组蛋白表达载 体，克服了现有技术中杆病毒不在双翅目昆虫中传播的技术偏见。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种表达载体，包含至少一个调控单元，所述调控单元含有增强子和启动子：
[0008] 其中，增强子为hrx增强子或其功能片段或序列变体;启动子为MT启动子或其功能 片段或序列变体，或Act5C启动子或其功能片段或序列变体；
[0009] 其中，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强子、Bombyx mori中的 hr3增强，或AcMNPV中的hr3增强子；
[0010] 所述的MT启动子为果蝇细胞金属硫蛋白启动子，其为诱导性启动子，受金属离子 诱导；
[0011] 所述的Act5C启动子为果绳细胞中的Actin 5C启动子。
[0012] 进一步地，所述hrx增强子与MT启动子或Act5C启动子连接。
[0013] 进一步地，作为优选方案，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强 子。
[0014] 更进一步地，hr5增强子采用如SEQ NO ID. 2第1-482位所示序列或与其具有70% 以上同源的序列。
[0015] 进一步地，所述MT启动子功能片段为SEQ NO ID. 1第1-422位所示序列或与其具有 70%以上同源的序列。
[0016] 进一步地，所述Actin 5C启动子功能片段为SEQ NO ID.3第3411-3711位所示序列 或与其具有70%以上同源的序列。
[0017] 上述表达载体可在果蝇S2细胞中应用，以果蝇S2细胞作为宿主细胞，所述果蝇S2 细胞中包含有所述表达载体。
[0018] 上述所述的表达载体的构建方法如下：
[0019] 当启动子为MT启动子或其功能片段或序列变体时：
[0020] 1)使用特异性寡核苷酸引物在PMT/V5-His的模板上扩增MT，扩增产物使用SapI和 Notl消化并在质粒pIEx-10亚克隆产生pMT;该特异性寡核苷酸引物为：
[0021] 5'-AAG CTC TTC TTG CAG GAC AGG ATG TGG T-3'；
[0022] 5'-AAG CGG CCG CCC CTT TAG TTG CAC TGA GAT-3'；
[0023] 2)使用另一特异性寡核苷酸引物在pMT/V5-His的模板上扩增MT并用Nhel和Notl 酶切在质粒pIEx-10中亚克隆产生phrMT;质粒phrMT即为所要构建的表达载体，其中保留了 hr5增强子和MT启动子;该另一特异性寡核苷酸引物如下：
[0024] 5'-AAA GCT AGC TTG CAG GAC AGG ATG TGG TG-3'；
[0025] 5'-AAG CGG CCG CCC CTT TAG TTG CAC TGA GAT-3'；
[0026] 当启动子为Act5C启动子或其功能片段或序列变体时：
[0027] 1)在pUC-Act的模板上采用如下引物进行扩增Act5C:
[0028] 5'-AAG CTC TTC AGT ACA CTC TTC ATG GCG AT-3'；
[0029] 5'-AAG CGG CCG CTC TCT GGA TTA GAC GAC TGC-3'；
[0030] 扩增产物使用SapI和Notl消化并在质粒pIEx-10中亚克隆产生pAct5C;
[0031] 2)在pUC-Act的模板上采用如下引物扩增Act5C:
[0032] 5'-AAA GCT AGC AGT ACA CTC TTC ATG GCG AT-3'；
[0033] 5'-AAG CGG CCG CTC TCT GGA TTA GAC GAC TGC-3'；
[0034] 扩增产物并用Nhel和NoU酶切在质粒pIEx-10中亚克隆产生质粒phrAct5C，即为 所要构建的表达载体，其中保留了 hr5增强子和Act5C启动子。
[0035] 本发明的有益效果在于:本发明构建了一个能够在双翅目昆虫果蝇S2细胞上高效 表达的含鳞翅目杆病毒基因 hrx增强子的重组蛋白表达载体，克服了现有技术中由于种属 隔离的原因，杆病毒不在双翅目昆虫中传播的技术偏见。
【附图说明】
[0036]图1为包含hr5增强子和MT启动子的表达载体，其中hr5增强子和MT启动子相连。图 1中表达载体还包含了Notl及BamM酶切位点以及终止子和抗性基因等部件；
[0037]图2为包含hr5增强子和Act5C启动子的表达载体，其中hr5增强子和Act5C启动子 相连。图2中表达载体还包含了Sbfl和Sph頂每切位点以及终止子和抗性基因等部件；
[0038]图3为瞬时表达的EGFP阳性细胞比例示意图；
[0039] 图4为瞬时表达的EGFP相对荧光单位示意图；
[0040] 图5为稳定表达的EGFP相对荧光单位；
[0041 ] 图6为瞬时表达的TNFR-Fc产量；
[0042] 图7为稳定表达的TNFR-Fc产量和稳定性；
[0043]图8为hr5增强子对MT启动子和Act5C启动子的相对产量影响；
[0044] 图9为每周取样通过夹心酶联免疫分析(sandwich ELISA)测定TNFR-Fc产量的结 果示意图；
[0045] 图10为hr5增强子对MT启动子及Act5C启动子的相对蛋白产量的增强作用示意图。
【具体实施方式】
[0046] 以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方 案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实 施例。
[0047] 实施例1
[0048] -种表达载体，包含至少一个调控单元，所述调控单元含有增强子和启动子：
[0049] 其中，增强子为hrx增强子或其功能片段或序列变体;启动子为MT启动子或其功能 片段或序列变体，其中，所述的hr x增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强子、Bombyx mor i中的hr 3增强，或AcMNPV中的hr 3增强子；
[0050] 所述的MT启动子为果蝇细胞金属硫蛋白启动子，其为诱导性启动子，受金属离子 诱导；
[0051 ] 进一步地，所述hrx增强子与MT启动子连接。
[0052] 进一步地，作为优选，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强子。 [0053] 更进一步地，hr5增强子采用如SEQ NO ID. 2第1-482位所示序列或与其具有70% 以上同源，优选80 %以上同源，更优选90 %以上同源，更优选95 %以上同源，最优选98 %以 上同源的序列。
[0054] 进一步地，所述MT启动子功能片段为SEQ NO ID. 1第1-422位所示序列或与其具有 70 %以上同源，优选80 %以上同源，更优选90 %以上同源，更优选95 %以上同源，最优选 98%以上同源的序列。
[0055] 上述表达载体可在果蝇S2细胞中应用，以果蝇S2细胞作为宿主细胞，所述果蝇S2 细胞中包含有所述表达载体。
[0056]上述表达载体的构建方法如下：
[0057] 1)使用特异性寡核苷酸引物在口11'/￥5-把8(1]1￥；[1：1'08611，巴塞尔，瑞士）的模板上 扩增MT，扩增产物使用SapI和Notl消化并在质粒pIEx-10亚克隆产生pMT，如图2所示，其序 列如SEQ NO ID. 1所示;该特异性寡核苷酸引物为：
[0058] 5'-AAG CTC TTC TTG CAG GAC AGG ATG TGG T-3'；
[0059] 5'-AAG CGG CCG CCC CTT TAG TTG CAC TGA GAT-3'；
[0060] 2)使用另一特异性寡核苷酸引物在pMT/V5-His的模板上扩增MT并用Nhel和Notl 酶切在质粒pIEx-10中亚克隆产生phrMT;质粒phrMT即为所要构建的表达载体，序列如SEQ NO ID. 2所示，其中保留了hr5增强子和MT启动子，如图1所示。该另一特异性寡核苷酸引物 如下：
[0061] 5'-AAA GCT AGC TTG CAG GAC AGG ATG TGG TG-3'；
[0062] 5'-AAG CGG CCG CCC CTT TAG TTG CAC TGA GAT-3'。
[0063] 实施例2
[0064] -种表达载体，包含至少一个调控单元，所述调控单元含有增强子和启动子：
[0065] 其中，增强子为hrx增强子或其功能片段或序列变体；启动子为Act5C启动子或其 功能片段或序列变体；
[0066] 其中，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强子、Bombyx mori中的 hr3增强，或AcMNPV中的hr3增强子；
[0067] 所述的Act5C启动子为果蝇细胞中的Actin 5C启动子。
[0068] 进一步地，所述hrx增强子与Act5C启动子连接。
[0069]进一步地，作为优选方案，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强 子。
[0070] 更进一步地，hr5增强子采用如SEQ NO ID. 2第1-482位所示序列或与其具有70% 以上同源，优选80 %以上同源，更优选90 %以上同源，更优选95 %以上同源，最优选98 %以 上同源的序列。
[0071] 进一步地，所述Actin 5C启动子功能片段为SEQ NO ID.3第3411-3711位所示序列 或与其具有70%以上同源，优选80%以上同源，更优选90%以上同源，更优选95%以上同 源，最优选98%以上同源的序列。
[0072] 上述表达载体可在果蝇S2细胞中应用，以果蝇S2细胞作为宿主细胞，所述果蝇S2 细胞中包含有所述表达载体。
[0073] 上述所述的表达载体的构建方法如下：
[0074] 1)在pUC-Act (Flybase)的模板上采用如下引物进行扩增Act5C:
[0075] 5'-AAG CTC TTC AGT ACA CTC TTC ATG GCG AT-3'；
[0076] 5'-AAG CGG CCG CTC TCT GGA TTA GAC GAC TGC-3'；
[0077] 扩增产物使用SapI和Notl消化并在质粒pIEx-10中亚克隆产生pAct5C，如图4所 示，序列如SEQ NO ID.3所示；
[0078] 2)在pUC-Act的模板上采用如下引物扩增Act5C:
[0079] 5'-AAA GCT AGC AGT ACA CTC TTC ATG GCG AT-3'；
[0080] 5'-AAG CGG CCG CTC TCT GGA TTA GAC GAC TGC-3'；
[0081 ] 扩增产物并用Nhel和Notl酶切在质粒pIE x-10中亚克隆产生质粒phrAct5C，即为 所要构建的表达载体，序列如SEQ NO ID.4所示，其中保留了hr5增强子和Act5C启动子。如 图2所示。
[0082]实施例3:宿主细胞
[0083] S2细胞系：来自果绳的Drosophila Schneider 2细胞系，已适应悬浮培养和无蛋 白质培养液。
[0084] S2细胞的增殖：S2细胞从TC Metrix公司（Epalinges，瑞士）获得，并在SF900 II SFM培养基中（Life Technologies公司，巴塞尔，瑞士)进行悬浮培养。细胞在TubeSpin生 物反应器 50(TS50)或在 TubeSpin 生物反应器600(TS600)(TPP，Trasadingen，瑞士）中培养， 其各自培养基的量分别为5-10mL或300mL。细胞每周传代2次，传代细胞密度为lxlO 6细胞/ mL。所有培养物在ISF1-X振荡培养器(KiihnerAG，Birsfelden，瑞士）中保持在28°C温度下， 摇晃速度为180rpm，摇动直径5厘米。细胞密度和活性通过台盼蓝排除法使用血细胞计数器 测定。
[0085] 在上述两个质粒的基础上，分别导入EGFP和TNFR-Fc基因，使其能分别表达这两个 蛋白。
[0086] 转染
[0087] 线性PEI (Polysciences，Eppenlheim，德国）配制为pH7 ·0,浓度lmg/ml 的水溶液， 经过过滤除菌并保存在-20摄氏度。对于小规模转染，将细胞离心并重悬于含培养基的TS50 管中。DNA和PEI直接加入细胞培养液中，或预混合在去离子水中再加入培养基。在不同的细 胞密度下进行转染并用新鲜培养基稀释。所有的细胞都在28摄氏度180rpm摇晃培养。
[0088] 对于300ml的转染，将细胞离心并重悬于含培养基的TS600管中。DNA和PEI预混合 在去离子水中再加入培养基。所有的细胞都在28摄氏度180rpm摇晃培养。
[0089]蛋白质定量
[0090] 将上述质粒导入EGFP和TNFR-Fc基因，从而表达出EGFP以及TNFR-Fc蛋白。EGFP阳 性细胞的百分比通过61^\^^85^5^6流式细胞仪(61^\^^6(：1111〇1〇8丨68，他5^^1(1，美国）测 定。激发光和发射光分别为488nm和SSSnnuEGFP的荧光定量通过TECANSaphirell荧光光度 计(TECAN，Maennedorf，瑞士）测定，激发光和发射光分别为485nm和515nm。
[0091] TNFR-Fc的浓度通过ELISA方法确定。使用羊抗人Fc γ抗体进行包被，并通过碱性 磷酸酶共聚羊抗人IgG γ链来检测TNF-Fc。加入底物后，在405nm和490nm下用读板器检测 吸收值。
[0092] 使用StreamlinerProtein A(GE，Uppsala，瑞典）纯化重组TNFR-Fc，并使用DC蛋白 检测(BioRAD，Reinach，瑞士)方法进行检测。
[0093] 瞬时表达的EGFP阳性细胞比例和相对荧光单位(RFU)分别见图5、图6;稳定表达的 EGFP相对荧光单位(RFU)见图7。
[0094] 细胞中，在细胞培养摇床(Kuhner，瑞士）内悬浮培养，转速180rpm，温度28°C。转染 后48小时培养基中的TNFR-Fc浓度通过所述的夹心酶联免疫分析（sandwich ELISA)测定 (Matasci等2011)。在瞬时表达中，采用了hr5增强子的表达载体其TNFR-Fc表达产量分别比 无 hr5增强子的表达载体增加126 %和115 % (图8)。
[0095] 而在稳定表达中，采用了 hr5增强子的表达载体TNFR-Fc产量更高，而长期稳定性 也有更好的保证。每周取样通过夹心酶联免疫分析(sandwich ELISA)测定TNFR-Fc产量，结 果见图9。
[0096]总结来说，hr5增强子对MT启动子及Act5C启动子的相对蛋白产量有着明显的增强 作用，其结果见图10。
[0097]对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，作出各种相应的 改变和变形，而所有的这些改变和变形都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种表达载体，包含至少一个调控单元，其特征在于，所述调控单元含有增强子和启 动子： 其中，增强子为hrx增强子或其功能片段或序列变体；启动子为MT启动子或其功能片段 或序列变体，或Act5C启动子或其功能片段或序列变体； 其中，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒AcMNPV中的hr5增强子、Bombyx mori中的hr3增 强子，或AcMNPV中的hr3增强子； 所述的MT启动子为果蝇细胞金属硫蛋白启动子，其为诱导性启动子，受金属离子诱导； 所述的Act5C启动子为果蝇细胞中的Actin 5C启动子。2. 根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述hrx增强子与MT启动子或Act5C启 动子连接。3. 根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的hrx增强子为鳞翅目杆病毒 AcMNPV中的hr5增强子。4. 根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，hr5增强子采用如SEQ NO ID.2第1-482位所示序列或与其具有70%以上同源的序列。5. 根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述MT启动子功能片段为SEQ NO ID. 1第1-422位所示序列或与其具有70%以上同源的序列。6. 根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述Actin 5C启动子功能片段为SEQ NO ID. 3第3411-3711位所示序列或与其具有70%以上同源的序列。7. 如权利要求1-6任一所述的表达载体在果蝇S2细胞中的应用，其特征在于，以果蝇S2 细胞作为宿主细胞，所述果蝇S2细胞中包含有所述表达载体。8. 如权利要求1-6任一所述的表达载体的构建方法，其特征在于， 当启动子为MT启动子或其功能片段或序列变体时： 1) 使用特异性寡核苷酸引物在pMT/V5-His的模板上扩增MT，扩增产物使用SapI和NotI 消化并在质粒PlEx-IO亚克隆产生pMT;该特异性寡核苷酸引物为： 57-AAG CTC TTC TTG CAG GAC AGG ATG TGG T-37 ； 5'-AAG CGG CCG CCC CTT TAG TTG CAC TGA GAT-37 ； 2) 使用另一特异性寡核苷酸引物在pMT/V5-His的模板上扩增MT并用NheI和NotI酶切 在质粒pIEx-10中亚克隆产生phrMT;质粒phrMT 即为所要构建的表达载体，其中保留了 hr5 增强子和MT启动子;该另一特异性寡核苷酸引物如下： 57-AAA GCT AGC TTG CAG GAC AGG ATG TGG TG-37 ； 5'-AAG CGG CCG CCC CTT TAG TTG CAC TGA GAT-37 ； 当启动子为Act5C启动子或其功能片段或序列变体时： 1) 在pUC-Act的模板上采用如下引物进行扩增Act5C: 57-AAG CTC TTC AGT ACA CTC TTC ATG GCG AT-37 ； 5，-AAG CGG CCG CTC TCT GGA TTA GAC GAC TGC-3,； 扩增产物使用SapI和NotI消化并在质粒pIEx-10中亚克隆产生pAct5C; 2) 在pUC-Act的模板上采用如下引物扩增Act5C: 57-AAA GCT AGC AGT ACA CTC TTC ATG GCG AT-37 ； 5，-AAG CGG CCG CTC TCT GGA TTA GAC GAC TGC-3,； 扩增产物用NheI和NoU酶切在质粒pIEx-10中亚克隆产生质粒phrAct5C，即为所要构 建的表达载体，其中保留了 hr5增强子和Act5C启动子。
【文档编号】C12N15/66GK105907788SQ201610281899
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】沈潇, 林兴华
【申请人】广州汉腾生物科技有限公司