一种受茉莉酸甲酯和白叶枯病菌诱导的启动子、其制备方法和重组表达载体与流程

本发明涉及植物基因工程
技术领域：
，特别涉及一种受茉莉酸甲酯和白叶枯病菌诱导的启动子、其制备方法、重组表达载体及转化子。
背景技术：
：水稻是我国最重要的粮食作物之一，而自然环境中的各种生物和非生物的胁迫是影响水稻产量的重量因素，如何提高水稻的胁迫抗性一直是育种工作者关注的热点问题，该胁迫抗性也成为抗逆性。随着对植物功能基因组的深入研究，越来越多的抗逆性相关基因被鉴定和克隆，使得通过基因工程手段获得抗逆境及抗病虫害的水稻品种成为可能，然而如何精细的调控外源抗性基因的表达是目前转基因育种工作面临的首要问题。启动子是遗传转化表达载体的重要元件，可以调控外源基因表达的部位及其强度。启动植物基因表达的启动子主要有三大类：组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。在前期研究中，研究人员主要采用组成型启动子，例如常见的花椰菜花叶病毒camv35s启动子、玉米泛素ubiquitin启动子和水稻肌动蛋白actin启动子来驱动外源抗性基因的表达，虽然这类启动子能稳定的表达抗性基因，但在提高植物抗病性的同时，大量的异源蛋白和代谢产物的积累往往会不同程度的影响植株的正常发育，获得的转基因植物不能应用于大田生产。与组成型启动子相比，诱导型启动子可以根据需求在植物特定的发育阶段或生长状态下，通过对植物施加某些特定的诱导源启动外源基因的表达，这种诱导源包括化学诱导剂以及自然条件下的生物和非生物胁迫。在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：一部分胁迫诱导启动子的确能在干旱、盐碱、低温、高温和病虫害等非生物胁迫信号或生物胁迫信号下启动基因的表达，但大多数启动子存在自身本底表达过低或者过高的现象；本底表达过低会造成诱导处理后的抗性基因虽然被诱导表达但表达程度不高，从而达不到抗性增强的目的；而本底表达高的诱导型启动子，会造成抗性基因在无诱导情况下的高表达，影响作物的正常生长。此外，目前广泛应用于植物转基因研究的地塞米松和雌二醇诱导的化学诱导剂系统，由于其对环境的负面影响过大，也都不适合大田里的广泛应用，这些都是启动子研究过程中需要解决的关键问题。相比之下，植物内源激素的诱导系统毒性小、对环境影响小，适合大田的长期应用；此外病原菌诱导系统能更加灵活的启动植物的抗病反应，仅在植物受侵染时驱动抗性基因的表达，从而抵抗病原菌的侵染。因此开发此类诱导型启动子的转化体系对植物转基因育种具有重要意义。技术实现要素：为了解决现有技术中的启动子诱导系统不能精细调控外源抗性基因的表达、不适用于大田广泛应用的问题，本发明实施例提供了一种受植物内源激素茉莉酸甲酯和白叶枯病菌诱导的启动子、其制备方法和重组表达载体。所述技术方案如下：一方面，本发明实施例提供了一种受茉莉酸甲酯和白叶枯病菌诱导的启动子，所述茉莉酸甲酯和白叶枯病菌诱导的启动子含有如序列表中seqidno.1所示序列，命名为prja140启动子。另一方面，本发明实施例提供了一种制备上述受茉莉酸甲酯和白叶枯病菌诱导的启动子的方法，所述方法包括：提取水稻的基因组dna；将所述基因组dna通过如序列表中seqidno:2所示的上游引物和seqidno:3所示的下游引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物，即所述受茉莉酸甲酯和白叶枯病菌诱导的启动子。具体地，所述pcr扩增的反应体系包括：5.8μlddh2o、10μl2×primestargcbuffer、2μl浓度为2.5mm的dntpmix、0.5μl浓度为10μm的所述上游引物、0.5μl浓度为10μm的所述下游引物、0.2μltakaraprimestartaq酶和1μl所述基因组dna，其中，基因组dna的浓度为200ng/μl。具体地，所述pcr扩增的程序为：98℃预变性5min；98℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸120s，扩增30个循环；72℃延伸10min。又一方面，本发明实施例提供了一种受茉莉酸甲酯和白叶枯病菌诱导的重组表达载体，所述受茉莉酸甲酯和白叶枯病菌诱导的重组表达载体包括报告基因，所述重组表达载体还包括位于所述报告基因上游的第一启动子，所述第一启动子为含有序列表中seqidno.1所示序列的所述受茉莉酸甲酯和白叶枯病菌诱导的启动子。具体地，所述表达载体以pcambia1381为骨架载体。具体地，所述报告基因为β-葡萄糖苷酸酶基因(gus基因)。具体地，所述报告基因下游的第一终止子为noster。具体地，所述重组表达载体还包括顺序连接的第二启动子、选择标记和第二终止子。具体地，所述第二启动子为35spro，所述选择标记为潮霉素抗性基因，所述第二终止子为35ster。本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的受茉莉酸甲酯和白叶枯病菌诱导的启动子，该启动子为多元诱导型启动子，既能够应答茉莉酸甲酯诱导，也能够应答白叶枯病菌的侵染，诱导前，在转基因的根和叶片中gus报告基因的表达量很低，说明该启动子自身表达水平低，该启动子在诱导12h时就能大量启动gus报告基因的表达，比诱导前增强25倍左右，说明该启动子应答速度快，诱导基因表达的程度高。所用的诱导系统为植物内源激素诱导系统和白叶枯病菌诱导系统，所述植物内源激素诱导系统毒性小、对环境影响小，适合大田的长期应用；本发明提供的受茉莉酸甲酯和白叶枯病菌诱导的诱导型启动子在植物表达载体中，能够通过人为的施加茉莉酸甲酯调控外源基因的表达，也可以在植物受到白叶枯病菌感染时自发激活外源基因的表达，避免因大量表达目标基因而可能造成的不利影响，可以在预防植物发病以及发病条件下快速、高效的启动抗性基因的表达，增强植物的抗性。该启动子的这些特征符合植物基因工程研究中理想启动子的要求，可以为植物基因工程提供有价值的材料。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本发明实施例提供的pcr扩增产物电泳图，其中，m为全式金trans2kplusdnamarker，条带大小从上而下分别为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、200bp、100bp；1为本发明实施例提供的prja140启动子；图2是本发明实施例提供的经ecorⅰ和salⅰ双酶切重组质粒的鉴定电泳图，其中m为全式金trans2kplusdnamarker，1-6分别为不同的检测质粒，且1、2、4、5为阳性(启动子成功转入重组质粒中)，3和6为阴性(未将启动子转入重组质粒中)；图3是本发明实施例提供的含prja140启动子的植物重组表达载体的构建示意图；图4是本发明实施例提供的部分t0代转基因水稻阳性检测电泳图，其中，条带大小从上而下为4500bp、3000bp、2000bp、1200bp、800bp、500bp和200bp；m为dnamarkerⅲ，1-7为t0代转基因水稻单株，8为野生型水稻作为阴性对照，9为pcambia1381-prja140-gus重组表达载体作为阳性对照；图5为本发明实施例提供的茉莉酸甲酯处理前转基因水稻的根的gus染色图，图中1为野生型水稻的根，2为转基因水稻的根；图6为本发明实施例提供的茉莉酸甲酯处理后转基因水稻的根的gus染色图，图中1为野生型水稻的根，2为转基因水稻的根；图7为本发明实施例提供的茉莉酸甲酯处理前转基因水稻的叶片的gus染色图，图中1为野生型水稻的叶片，2为转基因水稻的叶片；图8为本发明实施例提供的茉莉酸甲酯处理后转基因水稻的叶片的gus染色图，图中1为野生型水稻的叶片，2为转基因水稻的叶片；图9为本发明实施例提供的水稻白叶枯病菌侵染转基因水稻12小时后gus基因的表达水平。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。实施例1本发明实施例提供了一种受茉莉酸甲酯和白叶枯病菌诱导的启动子，该启动子含有如序列表中seqidno.1所示序列，命名为prja140启动子。下面简单介绍一下prja140启动子的制备方法，具体如下：提取水稻的基因组dna，利用ctab(hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)法(具体操作方法见murray&thompson,1980)提取正常生长的水稻叶片的基因组dna，然后用核酸蛋白测定仪q5000检测所提取的基因组dna的质量与浓度，并将提取的基因组dna的浓度稀释至200ng/μl作为prja140启动子的模版。其中，prja140启动子来源于水稻萜类合成酶基因loc_os02g36140。将模板通过如序列表中seqidno:2所示的上游引物和seqidno:3所示的下游引物进行pcr(polymerasechainreaction，聚合酶链式反应简称)扩增。表1为pcr扩增的反应体系试剂体积(μl)ddh2o5.82×primestargcbuffer10dntpmix(2.5mm)2上游引物(10μm)0.5下游引物(10μm)0.5takaraprimestartaq酶0.2模板1将表1中的pcr扩增的反应体系按照如下pcr扩增的程序进行：pcr扩增的程序为：98℃预变性5min；98℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸120s，扩增30个循环；72℃延伸10min。pcr扩增结束后，得到pcr扩增产物(即prja140启动子)，吸取10μlpcr扩增产物进行浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳检测结果见图1，得到的pcr扩增产物的条带大小为2272bp，将该pcr扩增产物进行测序，测序结果显示该pcr扩增产物与序列表中seqidno.1所示序列一致。实施例2用ecorⅰ(购置于neb公司)和salⅰ(购置于neb公司)分别对实施例1所得的pcr扩增产物和pcambia1381-gus载体进行双酶切，分别回收目的片段(prja140启动子)和pcambia1381-gus载体，并用t4dna连接酶(购置于neb公司)连接目的片段和pcambia1381-gus载体，得到pcambia1381-prja140-gus重组质粒，并通过热激法将pcambia1381-prja140-gus重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞trans-t1(购于全式金生物)中，具体操作方法见peasy-bluntcloningvector试剂盒的说明书，将转入pcambia1381-prja140-gus重组质粒的大肠杆菌感受态细胞trans1-t1涂布于含有100mg/l卡那霉素的lb(luria-bertani)平板培养基上，其中，1l的lb平板培养基含有10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠和15g琼脂，lb平板培养基的ph值为7.4，挑取单克隆进行扩繁提取重组质粒，利用ecorⅰ和salⅰ双酶切重组质粒并于浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳上鉴定重组质粒，鉴定结果见图2，挑选正确的重组质粒(图2中的阳性1、2、4和5)进行测序验证，经测序后比对结果正确，表明重组表达载体pcambia1381-prja140-gus构建成功，可进一步通过热激法将pcambia1381-prja140-gus重组表达载体转入农杆菌感受态细胞eha105(购置于上海士锋生物科技有限公司)，用于后续植物转基因。其中，pcambia1381-prja140-gus重组表达载体的结构示意图如图3所示，在该pcambia1381-prja140-gus重组表达载体中prja140启动子和35spro分别为第一启动子和第二启动子，noster和35ster分别为第一终止子和第二终止子，hptⅱ是重组表达载体的选择标记潮霉素抗性基因，gus(β-葡萄糖苷酸酶基因)基因为报告基因，该pcambia1381-prja140-gus重组表达载体可通过gus基因的表达情况来判断prja140启动子的活性。实施例3通过农杆菌介导的转化方法将实施例2所得pcambia1381-prja140-gus重组表达载体转入水稻中，采用hiei等人报道的方法(hiei等，efficienttransformationofrice(oryzasatival.)mediatedbyagrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesofthet-dna.plantj，1994，6:271-282)将pcambia1381-prja140-gus重组表达载体转入受体材料“中花11”里，转化过程中使用的培养基和试剂主要参照华中农业大学的授权专利(专利号zl200710053552.9，发明的名称：水稻广亲和基因s5的分离克隆及应用；专利公开日：2008年6月18日；公开号：cn101200725；专利授权日：2010年04月21日)，本发明实施例的步骤与上述文献的不同之处在于：水洗愈伤组织和抗性愈伤筛选的方法。本发明实施例的具体操作步骤如下：(1)用无菌水逐步洗涤水稻愈伤组织至愈伤表面看不见农杆菌为止。(2)将步骤(1)所得的愈伤组织在含有浓度为300mg/l羧苄青霉素(cn)的无菌水中浸泡30min。(3)将步骤(2)所得的愈伤组织转移至灭菌吸水纸上，干燥愈伤组织。(4)将步骤(3)所得的愈伤组织转移至选择培养基上，每2周更换一次选择培养基(第一次选择培养基中潮霉素的浓度为300毫克/升，第二次及其以后的选择培养基中潮霉素的浓度为250mg/l，且本实施例中提供的选择培养基的成分与专利号zl200710053552.9中提供的选择培养基的成分相同)，愈伤组织于选择培养基中发育成植株，该植株为t0代转基因植株，命名为prja140-n，其中n＝1,2,3…代表转基因所得的不同家系。采用ctab法提取t0代转基因水稻叶片的基因组dna，然后通过gus基因引物并采用pcr法对t0代转基因水稻叶片的基因组dna进行阳性检测，检测体系和表1中的pcr扩增的反应体系相同，且pcr扩增的程序如上，部分植株的检测结果见图4，gus基因引物包括如序列表中seqidno:4所示的上游引物和如序列表中seqidno:5所示的下游引物。关于受茉莉酸甲酯和病原菌诱导的诱导型启动子的活性鉴定分别对野生型水稻和t0代转基因水稻种子进行消毒处理，具体操作方法为：用浓度70％的乙醇浸泡种子50s，再然后用浓度为1％的次氯酸钠溶液浸泡种子8-10min，最后用无菌水洗涤5-7次。将处理好的种子摆放至含有1/2ms(ms试剂购于sigma公司)生根培养基(1/2指该ms生根培养基的成分用量为常规用量的一半)的生根管中，于25℃条件下的人工气候培养箱中生长2周，且16h光照和8h黑暗交替培养，并分别进行茉莉酸甲酯处理转基因水稻后prja140启动子的活性检测和接种白叶枯病菌后prja140启动子的活性检测。茉莉酸甲酯处理转基因水稻后prja140启动子的活性检测：挑选生长状态一致的野生型水稻和t0代转基因水稻材料进行处理实验，用喷壶均匀喷洒浓度为0.2mm的茉莉酸甲酯溶液(茉莉酸甲酯原液购于sigma公司)至待处理材料的叶片上，分别对处理前0h和处理后12h的野生型水稻和转基因水稻的叶片和根进行gus染色；染色过程中将待染叶片剪成1cm长，加入能完全使水稻叶片和根浸泡住的非扩散型gus染液(购于北京奥博来科技有限责任公司)，抽真空5min，37℃黑暗染色12h，最后用无水乙醇浸泡脱色。脱色后水稻叶片和根都变成白色，其中，有gus基因表达的部位会显示蓝色，颜色越深表示gus基因表达水平越高。图5和图6分别为茉莉酸甲酯处理前后转基因水稻根的gus染色图。图7和图8分别为茉莉酸甲酯处理前后转基因水稻叶片的gus染色图。如图5-图8所示，将染色图调整为灰白底色后的图片中，深色部位为gus染色部位，茉莉酸甲酯处理前，野生型水稻和t0代转基因水稻染色都不明显；经茉莉酸甲酯处理12h后，t0代转基因水稻的叶片和根较野生型水稻都有明显的染色，说明在正常条件下prja140启动子驱动基因的表达水平非常低以致很难检测到，而在茉莉酸甲酯的诱导下能大量的启动目标基因的表达。接种白叶枯病菌后prja140启动子的活性检测：同样挑选生长状态一致的野生型水稻和t0代转基因水稻材料进行处理实验，接种所用的白叶枯病菌p1在使用前先在灭菌后的马铃薯培养基(马铃薯培养基的制备方法为：取300g去皮的马铃薯切块煮烂，并用纱布过滤，得到溶液，在该溶液中加入0.5gca(no3)2、2gnah2po4、15g蔗糖、5g蛋白胨和20g琼脂粉，调整溶液的ph值至6.8-7.0后加水至1l)上活化，于28℃下培养2～3天，用无菌水稀释培养好的农杆菌，并通过比浊法将农杆菌的菌液浓度稀释至9×109个/ml，通过剪叶法将农杆菌的菌液接种于转基因叶片上，具体地，用蘸有农杆菌菌液的剪刀剪转基因水稻的叶片。取接种前0h和接种12h的转基因水稻叶片进行表达检测。首先用invitrogen公司的trizol抽提试剂盒，按照试剂盒上的方法提取待检测叶片的rna，然后用核酸蛋白测定仪q5000检测所提取的rna的浓度与质量，再用全式金生物技术有限公司的transcriptone-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix试剂盒进行rna的反转录，得到反转录产物，再用全式金生物技术有限公司的transstartgreenqpcrsupermix试剂盒进行反转录产物的定量扩增，用上游引物的序列如序列表中seqidno:6所示，所用的下游引物的序列如序列表中seqidno:7所示检测gus基因表达水平，上述反应均在stepone-plus定量pcr仪(appliedbiosystems)上进行，具体操作过程均按照ransstartgreenqpcrsupermix试剂盒及仪器的操作手册进行。将水稻actin基因(登录号ak060893.1)作为反应中的内部参考基因，通过序列如序列表中seqidno:8所示的上游引物和序列如序列表中seqidno:9所示的下游引物，利用实时荧光定量pcr检测白叶枯病菌侵染后gus基因的表达水平，pcr反应程序为：95℃预变性30s；94℃变性5s，60℃退火30s，扩增40个循环；检测样品设置三个生物学重复，以水稻actin基因的表达值对每个样品进行均一化处理，同时，采用2^(-△△ct)法计算样品间基因表达差异，结果参见图9，如图9所示，在白叶枯病菌p1侵染12h后的叶片中gus基因的表达诱导非常明显，说明该prja140启动子也能被白叶枯病菌所诱导并启动下游报告基因的表达。本发明实施例提供的受茉莉酸甲酯和白叶枯病菌诱导的启动子，该启动子为多元诱导型启动子，既能够应答茉莉酸甲酯诱导，也能够应答白叶枯病菌的侵染，诱导前，在转基因的根和叶片中gus报告基因的表达量很低，说明该启动子自身表达水平低，该启动子在诱导12h时就能大量启动gus报告基因的表达，比诱导前增强25倍左右(具体见图9)，说明该启动子应答速度快，诱导基因表达的程度高。所用的诱导系统为植物内源激素诱导系统和白叶枯病菌诱导系统，所述植物内源激素诱导系统毒性小、对环境影响小，适合大田的长期应用；本发明提供的受茉莉酸甲酯和白叶枯病菌诱导的诱导型启动子在植物表达载体中，能够通过人为的施加茉莉酸甲酯调控外源基因的表达，也可以在植物受到白叶枯病菌感染时自发激活外源基因的表达，避免因大量表达目标基因而可能造成的不利影响，可以在预防植物发病以及发病条件下快速、高效的启动抗性基因的表达，增强植物的抗性；此外白叶枯病菌导系统能更加灵活的启动植物的抗病反应，仅在植物受侵染时驱动抗性基因的表达，从而抵抗病原菌的侵染，这使得本发明实施例提供的启动子及其重组表达载体对植物转基因育种具有重要意义。该启动子的这些特征符合植物基因工程研究中理想启动子的要求，可以为植物基因工程提供有价值的材料。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>江汉大学<120>一种受茉莉酸甲酯和白叶枯病菌诱导的启动子、其制备方法和重组表达载体<160>9<170>patentinversion3.4<210>1<211>2272<212>dna<213>人工序列<400>1gcactgctcgcttagtaccgtggtggggcccaccagaagaaattatcactaatcttgatc60gtgtctcttgggcgcggttccagaagcttccgtccaagcaatgagtttccttctctcccg120aaataaacaaatttatagagtttaaattttatttaaaaataaattaattcatatcttcct180acgtttcatcgaaatcaattattatcaaacaatcacaaataatcaaatacggtcctcgta240agaaaaatcaattaattgtgaataaagaaatttgcggagtgggcgctgccacactgttta300taatagagggcagtcaaatttctgttgtgggtcacacactttggacacgagcctgagaaa360aagcggttgatcagcaaattttgtccacatactgaccagaaaatttgcattccacacttt420tgtctgaaaaaatttccaactaatccgctctcttacaaagtgttcttcgatgttttcctt480cagacgggaagagagacttctaccatgtatagttatgctctcttcgtctttttcatatgt540tctgccctctatttttctcagtcgctctttctctattttactcgttattaatccctcaac600aacgaaaaagaaaagggaaatcaaattattgcatcacccagtagtatatgttcgtttctt660ctaaataccccccctcccggccccacttcatattaatcgttcaacttttctttttcaaac720ttttttaagtttgataaaatttatagaaaaatataataattttttaatacaaaacaagca780tattatcaaaataaaatatattcaatgttaaatttaattaaactaataaatattgcaaac840ttttcaataaacttgatcaaacaaaaataaatttgacaaaaaaaagtcaaacgacttata900atatgaaaagagagtatgactatgacatgctaaactcaataaaacaaagtttatgtgaat960tagcatatccaagatgacactttaatttttatatgtaccaccaacttaatttgaaatttg1020caaccatgtcaacaaacttcatttgaaactctctatttgtgttgtcattaccaacaaaat1080aaattagggatcctagagaaaatgagcgtagcttaattggttaggttccttgcagtgaaa1140ccagctcactcgatttcaagtctcaacttgacacgggtgctcgcatttacggttgaacaa1200agttgcaaattaagtttgttttagagctggtttggtttgaggcctaaattggccttacaa1260atatttgtcaatttcaatagtgtttattgtctatttggtttgaagccaaattttggcatg1320cctaagaaaataggccatttcaacagttaatttaggctattttggcttcaatccaaacat1380aattttacctttgccaaaattagcaatgccaaaatttgacattgacaaaaattgataagg1440ccaatttaggccacaaaccaaaccagcccttagttacacaagcttccccaaaaatctctt1500tgta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