一种表达外源基因的启动子及其应用的制作方法

本发明属于生产菌株构建中应用的启动子技术领域，具体涉及一种用于芽孢杆菌发酵表达外源基因的启动子及其应用。

背景技术：

构建芽孢杆菌高效表达平台，启动子起到阀门的作用。当启动子基因转录效率高时，该启动子被称为强启动子，反之为弱启动子。在启动子分类中，细胞生存周期里持续表达，被称作组成型启动子。组成型启动子能大大提高基因的转录效率，强启动效应不需要其他物质诱导，因此能提高经济效益。p43是枯草芽孢杆菌基因工程改造常用的启动子之一，初始的功能是强启动胞苷脱氨酶的基因转录。其他强启动子还有pxyla、p1398和psacb等，这些启动子作为起始转录调控元件构建了多种外源蛋白表达重组型质粒。另外，还有组合型启动子，将两个、三个或更多启动子元件进行优化拼接，形成转录功能更为高效的人工启动子。

启动子又分为组成表达型或诱导表达型，诱导表达型启动子通常在正常的细胞生长周期时不会发挥功能，只有在加入诱导因子诱导后才能调控下游的基因转录。诱导因子分为环境因子和化学因子，环境因子例如：渗透压、ph值、氧含量、温度等，往往启动子的序列里存在调控区间。利用化学因子诱导的启动子，往往在诱导下转录效率可以提升许多倍，因此也经常作为调控元件与组成型启动子连接构建全新的诱导启动子。如枯草芽孢杆菌pspac为人工合成的启动子，将枯草芽孢杆菌spo1序列和大肠杆菌乳糖操纵子元件laco进行连接，使得其能被iptg诱导。而pxyl启动子，可以受木糖诱导进行转录表达，其中阻遏物xylr能与诱导物木糖结合，从而抑制效应解除。上述启动子在芽孢杆菌的基因工程菌构建中应用广泛，但是对于新的可调控启动子的探索仍在继续，理想的启动子应当具备诱导性强，调控成本低，工业应用潜力大等优点。

技术实现要素：

本发明的目的是，提供一种表达外源基因的启动子及其应用。该启动子可用于多种芽孢杆菌中高效发酵生产外源蛋白。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

一种表达外源基因的启动子，该启动子的核苷酸序列选自以下其中一种：

(1)如seqidno.1所示的核苷酸序列或与其反向互补的核苷酸序列；

(2)对seqidno.1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失或添加修饰且具有相同启动子功能的核苷酸序列；

(3)与seqidno.1所示的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同启动子功能的核苷酸序列。

本发明中，所述表达外源基因的启动子被命名为pholin，启动子pholin优选为如seqidno.1所示的核苷酸序列。该核苷酸序列可通过化学合成的方法获得。

本发明公开的启动子与原始的φ105噬菌体中的启动子序列(如seqidno.2所示)有核苷酸序列的改变。改变之一如seqidno.3所示，另一处改变如seqidno.4所示。

本发明还提供所述启动子在构建重组蛋白表达质粒中的应用，以及在构建微生物生产菌株中的应用。优选地，所述微生物为芽孢杆菌。优选地，所述芽孢杆菌选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解链淀粉芽孢杆菌。

本发明还提供包括所述启动子的质粒，该质粒的核苷酸序列如seqidno.5所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明中公开的启动子pholin的发酵研究结果表明，启动子pholin能在包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等微生物菌株中，高效起始下游外源基因的表达，可以用于工业蛋白生产菌株的构建。

本发明的启动子属于高效表达分子元件，可以高效地启动外源蛋白，特别是工业酶制剂的发酵生产，在重组蛋白表达应用中，该启动子经自发启动，无需添加额外诱导物，主要用于芽孢杆菌，包括，但不限于，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解链淀粉芽孢杆菌等工业生产菌株的构建。

附图说明

图1为克隆了启动子pholin的表达质粒pmk4-pholin-gfp的构建流程图。

图2是五种质粒pmk4-gfp、pmk4-pholin-gfp、pmk4-pxyla-gfp、pmk4-p43-gfp、pmk4-p1398-gfp，分别转入枯草芽孢杆菌中发酵表达绿色荧光蛋白gfp的荧光量示意图。

图3是质粒pmk4-pholin-amyl的构建流程图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

实施例1构建质粒pmk4-pholin-gfp并在枯草芽孢杆菌中表达绿色荧光蛋白gfp

质粒pmk4-pholin-gfp的构建流程参见图1，设计的启动子核苷酸序列送交生物公司进行了dna合成，并ta克隆到载体puc57上，将puc57-pholin和携带启动子p43的质粒pmk4-p43-gfp同时进行限制性内切酶psti和xmai消化，酶切片断以试剂盒清洁。后用t4dna连接酶连接进行连接，构建了pmk4-pholin-gfp质粒。

所有质粒均以pmk4(购自bgsc公司)为载体质粒，pmk4与gfp片段经bamhi、ecori双酶切，t4dna连接酶连接得到pmk4-gfp，pmk4-pxyla-gfp为pmk4与pxyla-gfp经psti单酶切，t4dna连接酶连接获得；pmk4-p1398-gfp为pmk4-pxyla-gfp与p1398经psti、xmai酶切，t4dna连接酶连接得到；pmk4-p43-gfp为pmk4-pxyla-gfp与p43经psti、xmai酶切，t4dna连接酶连接得到。上述限制性内切酶及其体系购自thermoscientific公司，连接酶购自takara公司。所构建的序列均送生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证。

实施例2gfp表达质粒的转化与表达

本实施例中，将构建的质粒pmk4-pholin-gfp、pmk4-p1398-gfp、pmk4-p43-gfp、pmk4-pxyla-gfp、pmk4-gfp分别转化进入枯草芽孢杆菌164s菌株中，转化pmk4-pholin-gfp的具体操作如下(其他质粒的转化方法相同)：首先，把平板活化的单菌落接种到3mllb试管中，37℃、200rpm培养10～12h，然后，取300μl转接到预热的3mllb试管中，加入滤膜灭菌的的木糖母液至终浓度为1％，37℃、200rpm培养3h后分装到2mleppendorf管中，加入质粒pmk4-pholin-gfp，加入量100μgdna/100μl转化液，然后孵育，在37℃摇床中200rpm培养1.5h后涂5μg/ml的氯霉素抗性板，37℃恒温箱过夜培养筛选。筛选得到的菌株接种到lb培养基中，lb培养基组分为酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl10g/l，置于500ml三角瓶中进行摇瓶发酵培养，30℃，200rpm，每隔4hr取一次样。细胞发酵液梯度稀释100倍，取200μl置于96孔板中，利用酶标仪进行产物的检测。选择激发光波长485nm，检测光波长520nm。测定结果见图2，该图为五种构建的质粒转入枯草芽孢杆菌164s菌株中发酵生产绿色荧光蛋白gfp的荧光量示意图。

通过图2可以看出：在lb培养基中，发酵培养48h时pholin启动子构建的质粒表达绿色荧光蛋白gfp的荧光强度值为55799.0a.u.，与其他启动子横向比较，为pxyla启动子的4.28倍，p43启动子的2.62倍，为p1398启动子的1.88倍。

实施例3质粒pmk4-pholin-amyl的构建及发酵生产

利用基因组提取试剂盒，提取地衣芽孢杆菌的全基因组。以地衣芽孢杆菌基因组amyl段序列seqidno.6为模板，采用引物seqidno.7和seqidno.8进行扩增。pcr仪反应程序：预变性95℃5min；变性98℃10s；退火50℃10s；延伸72℃，1kb/min，30个循环。pcr产物经axygenpcr清洁试剂盒回收纯化。

质粒pmk4-pholin-gfp进行xmai/ecori双酶切并经清洁后，按比例和纯化后的pcr产物进行一步法克隆(infusioncloning)，所用试剂盒为商业购买的试剂盒onestepcloningkit，电转感受态大肠杆菌dh5α后，经酶切和测序验证获得amyl的表达质粒pmk4-pholin-amyl，参见图3，该图为质粒pmk4-pholin-amyl的构建流程图。然后以电转化的方法将pmk4-pholin-amyl质粒转入地衣芽孢杆菌jbaci；筛选得到的菌株接种到工业蛋白培养基中，工业蛋白培养基组分为为玉米粉6.5％、豆粕4％、麸皮5.5％、na2hpo4·12h2o0.3％、kh2po40.03％(均为质量分数)。将50ml接入菌株的工业蛋白培养基置于500ml三角瓶中进行摇瓶发酵，30℃，200rpm，每隔6～12hr取一次样，将样品进行离心，5000g，2min，取上清进行淀粉酶酶活的测定，酶活的测定利用国标方法gb/t82752009进行，测定结果为：在0-36h的发酵培养期间，发酵液中的酶活呈线性上升趋势。在发酵培养36h时，酶活达到峰值12465u/ml。继续发酵培养，酶活有所下降，在发酵培养36h时，酶活为11827u/ml。因此，利用本发明的启动子pholin构建的质粒在地衣芽孢杆菌中表达淀粉酶，得到的淀粉酶摇瓶酶活>10000u/ml，完全满足工业生产需求。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

sequencelisting

<110>中国科学院上海高等研究院

<120>一种表达外源基因的启动子及其应用

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