桑树小分子热激蛋白基因Mn16.8-CⅠ启动子及其重组表达载体和应用
【专利摘要】本发明公开了桑树小分子热激蛋白基因Mn16.8?C Ⅰ启动子及其重组表达载体和应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，该基因在高温胁迫下能够上调下游基因表达，因此可以利用该基因的特性，通过温度调控目的基因表达从而调控植物抗逆性或调控抗病能力；同时为研究植物抗逆、抗病等提供了重要的启动子元件，也可以用于植物抗逆基因工程育种，因而具有广泛的应用价值。
【专利说明】
桑树小分子热激蛋白基因 Mn16.8-G I启动子及其重组表达载 体和应用
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及桑树小分子热激蛋白基因 Mnl6.8-c I启动 子，还涉及含有桑树小分子热激蛋白基因 Mnl6.8-C I启动子的重组表达载体及相应的应 用。
【背景技术】
[0002] 生长在自然环境中的植物不可避免地受到各种环境胁迫的危害。当遭受逆境胁迫 后，植物启动应激反应，其形态结构、生理生化和分子水平上发生一系列变化。在长期进化 过程中，植物发展和形成了一套复杂的机制以适应周围环境的变化。
[0003] 植物在高温胁迫下能迅速合成一类蛋白质一热激蛋白（HSPs) dSPs作为分子伴 侣，能协助新生肽链折叠、组装、定位、运输，修复胁迫下的变性蛋白及降解错误折叠的蛋 白。小分子量热激蛋白（sHSPs)是一类种类较多、结构复杂、具有功能多样性的热激蛋白。在 高温胁迫下，sHSPs结合非天然蛋白防止其发生不可逆聚集，在植物抵抗高温胁迫中发挥重 要作用。
[0004] 桑树是一种多年生木本植物，除了其桑叶能为家蚕提供食物外，桑树还具有重要 的药用、食用价值以及生态保护功能。桑树作为优良的生态经济树种，对高温、干旱、高盐、 低温等逆境胁迫具有一定的抗逆性。但是，目前对桑树抗逆性的机制研究较少，特别是桑树 在高温胁迫下如何调控下游基因表达未见报道。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供桑树小分子热激蛋白基因 Mnl6.8_C I启动 子;本发明的目的之二在于提供含有桑树小分子热激蛋白基因 Mnl6.8-C I启动子的重组表 达载体;本发明的目的之三在于提供桑树小分子热激蛋白基因 Mnl6.8-C I启动子在高温胁 迫下诱导基因表达中的应用；本发明的目的之四在于提供桑树小分子热激蛋白基因 Mnl6.8-C I启动子在调控植物抗逆性或调控抗病能力中的应用。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0007] 1、从桑树基因组取Mnl6.8-C I基因上游1500bp启动子序列设计引物，克隆并测序 验证，获得桑树小分子热激蛋白基因 Mnl6.8-CI启动子，其核苷酸序列如SEQIDN0.3所 不。
[0008] 2、利用桑树小分子热激蛋白基因 Mnl6.8-C I启动子构建重组表达载体，优选为由 如SEQIDN0.3所示的序列连入植物表达载体pBI121的HindIΠ 和BamHI酶切位点，获得 pBI121-Mnl6.8-C I 。
[0009] 3、所述桑树小分子热激蛋白基因 Mnl6.8-C I启动子在高温胁迫下诱导基因表达 中应用;优选的，所述高温为温度高于35°C ;更优选的，所述高温为温度为35~39°C。
[0010] 利用桑树小分子热激蛋白基因 Mnl6.8-C I启动子受高温诱导表达，在启动子下游 连接功能基因，如抗逆基因或抗病基因，从而调控植物的抗逆性或调控抗病能力。
[0011] 本发明的有益效果在于:本发明提供的桑树小分子热激蛋白基因 Mnl6.8-c I启动 子，可在植物受到高温胁迫是启动目的基因表达，当逆境胁迫消失时，目的基因的表达量又 会迅速恢复，因此不会影响植物整个生长发育过程，可以广泛应用于植物抗逆基因工程育 种中。
【附图说明】
[0012] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0013] 图1为桑树小分子热激蛋白基因 Mnl6.8-c I启动子和pBI121-PMnl6.8-C I转基因 载体的构建（a:载体构建示意图，b:重组质粒的电泳检测及双酶切验证。M:Maker，1 : Mnl6.8-C I promoter，2:pBI121，3:pBI121-PMnl6.8-C 1，4:双酶切pBI121-PMnl6.8-C 1)〇
[0014] 图2为Mnl6.8-c I启动子在转基因烟草中的PCR鉴定(M:Maker，WT:野生型烟草，T: 转基因烟草）。
[0015] 图3为野生型与转基因烟草表型。
[0016]图4为野生型和转基因烟草在25°C和37°C下的⑶S表达活性分析(WT:野生型烟草， T:转基因烟草）。
[0017] 图5为转基因烟草高温胁迫下的GUS表达活性分析(WT:野生型烟草，T:转基因烟 草)。
【具体实施方式】
[0018] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著） 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0019]实施例！、桑树小分子热激蛋白基因 Mnl6.8-C I启动子获得 [0020] 从桑树基因组数据库中鉴定了 29个sHSPs，对29个sHSPs进行基因结构、转录调控 元件和组织表达谱分析后发现，Μη 16.8-C I基因启动子中含有完整的热激元件(HSE)，在高 温、低温、干旱和高盐胁迫下，基因表达上调。为研究Mnl6.8-C I启动子的活性，取Mnl6.8-C I基因上游1500bp启动子序列设计引物，克隆并测序验证。利用植物转基因技术，将其插入 植物表达载体PBI121中，具体方法如下：
[0021] 根据川桑基因组序列，截取Mnl6.8-C I基因上游1500bp序列设计引物作为克隆 Mnl6.8-C I启动子(Mnl6.8-C I pro)的引物，具体引物如下：
[0022] Mnl6.8-C I pro 上游引物：5 ' -cccaagcttGGTCCGGCCGTGGTGCGT-3 '（ SEQ ID NO. 1)，下划线表示Hindm酶切位点；
[0023] Mnl6.8-C I pro下游引物：5'-cgggatccTTCTATGATTATTAGCCTTGCTGTG_3'（SEQ ID NO.2)，下划线表示Bam Η I酶切位点；
[0024] 然后以川桑基因组DNA为模板，SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示序列为引物进行 PCR扩增，PCR扩增体系为：10XEx-taq buffer 2.5yL，25mM MgCl2 2yL，2.5mM dNTP 2yL， 川桑基因组DNA 30ng，10μΜ上、下游引物各lyL，5U/yl Ex-taq聚合酶0.2yL，灭菌水补足至 25yL; PCR扩增条件为94°C预变性4分钟；94 °C变性40秒，60 °C退火40秒，72 °C延伸2分钟，进 行30个循环;最后72°C延伸10分钟，4°C保存。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1中b 所示。结果显示，扩增获得约1500bp的条带，即Mnl6.8-C I pro,经测序获得Mnl6.8-C I pro序列如SEQ ID NO.3所示。
[0025] 然后将扩增获得的Mnl6.8-C I pro经Hindm和Bam Η I酶切后连入同样经Hind ΙΠ 和Bam Η I酶切的植物表达载体pBI121中，获得含有Mnl6.8-C I pro的重组表达载体，命 名为pBI121-PMnl6.8-C I，载体结构如图1中a所示。
[0026] 实施例2、Mnl6.8_C I启动子转基因烟草的获得与鉴定
[0027] 利用叶盘转化法将构建的pB1121 -Μη 16.8-C I表达载体转化烟草，经过kan抗性筛 选，共获得5株转基因烟草植株，分别命名为T1~5。取5株转基因烟草的叶片，提取基因组 DNA作为模板，同时以野生型烟草基因组作为对照，用Mnl6.8-C I启动子上游引物和⑶S基 因特异性引物进行PCR扩增，其中GUS基因特异性引物的序列如下：
[0028] 5'_cgaggtacggtaggagttgg_3'（SEQ ID N0.4);
[0029] PCR扩增条件为94 °C预变性4分钟;94 °C变性40秒，60 °C退火40秒，72 °C延伸2分钟， 进行30个循环;最后72°C延伸10分钟，4°C保存;扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2 所示。结果显示，野生型烟草无扩增产物，转基因烟草扩增产物均与预期大小一致，表明 Mnl6.8-C I启动子均插入到转基因烟草基因组中。
[0030] 随机选择T1、T3和T5为功能研究对象，然后同时将野生型和转基因烟草移栽至土 中，4周后观察表型，结果如图3所示。结果显示，转基因烟草与野生型烟草表型无明显差异。
[0031] 如图3所示，野生型和转基因烟草移栽至土中4周后，表型无明显差异。然后分析3 株转基因烟草TUT3和Τ5启动子的表达活性，具体如下:取在正常生长条件25°C下和37°C处 理后的WT、T1、T3和T5的离体叶圆片，进行⑶S组织化学染色，结果如图4所示。结果显示，37 °(：处理后，WT仍无蓝斑，而ΤΙ、T3和T5明显观察到蓝斑，表明Mnl6.8-C I启动子能驱动下游 GUS基因表达。
[0032]取 T1、T3 和 T5 的离体叶圆片，分别在 35°(：、36°(：、37°(：、38°(：、39°(：下处理211后，61]3 组织化学染色，观察表达活性，结果如图5所示。结果显示，WT无蓝斑(无⑶S基因的表达），而 转基因烟草Τ1、Τ3和Τ5明显观察到蓝斑，而且GUS表达活性随温度的增加而升高，表明 Mnl6.8-C I启动子能在高温处理下诱导下游GUS基因表达，并且在温度高于38°C条件下表 达活性更强。
[0033]最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 桑树小分子热激蛋白基因 Mnl6.8-CI启动子，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。2. 含有权利要求1所述桑树小分子热激蛋白基因 Mnl6.8-CI启动子的重组表达载体。3. 根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体由如SEQ ID NO. 3所示的序列连入植物表达载体pB 1121的Hind ΙΠ 和BamHI酶切位点而得。4. 权利要求1所述桑树小分子热激蛋白基因 Mnl6.8-CI启动子在高温胁迫下诱导基因 表达中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述高温为温度高于35 °C。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于:所述高温为温度为35~39 °C。7. 权利要求1所述桑树小分子热激蛋白基因 Mnl6.8-CI启动子在调控植物抗逆性或调 控抗病能力中的应用。
【文档编号】C12N15/113GK105838716SQ201610283570
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月3日
【发明人】何宁佳, 卢承琼, 曾其伟
【申请人】西南大学