一种从三文鱼罐头中提取dna的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从三文鱼罐头中提取DNA的方法。进一步地，本发明的方法看用于鉴别三文鱼罐头中三文鱼品种。本发明的方法可以包括如下步骤：a)：称取一定质量的三文鱼罐头样品，利用DNA提取液提取DNA，其中所述的DNA提取液的组成为：4％CTAB、100mmol/L Tris?HCl(pH 8.0)、1.4mol/L NaCl、20mmol/L EDTA(pH 8.0)；b)：以a)中得到的DNA为模板，扩增出COI的212bp的DNA片段；c)：将b)中扩增得到的片段进行测序，与已有DNA数据库进行序列特征比对，得到三文鱼品种信息。本发明建立了能成功提取用于鉴别三文鱼罐头中三文鱼品种的DNA的方法，对提高我国罐头工业产品质量安全水平，规范行业发展，保护消费者合法权益和知情权具有十分重要的现实意义。
【专利说明】
-种从H文鱼罐头中提取DNA的方法
技术领域
[0001 ] 一种提取DNA的方法，特别是从S文鱼罐头中提取DNA的方法。根据本发明的方法 所提取的DNA可用于鉴别S文鱼罐头中S文鱼品种，进而用于鉴别食品真实性。
【背景技术】
[0002] =文鱼，是娃縛科鱼类的总称，食用性名贵鱼类，主要分布于高缔度地区的冷水鱼 类，由于其含有丰富蛋白质和人体所需的脂肪酸，健康绿色无污染，营养价值较高，深受大 众的喜爱。娃科鱼包括3亚科7属36种，主要为娃亚科(Salmoniae)，白娃亚科(Coregoninae) 和茵鱼亚科(Thymallidae)。食品法典委员会CAC(O)DEX STAN 3-1981KS文鱼罐头》中规 定，大西洋娃鱼（Salmo salar)、红大麻哈鱼（Oncorhynchus nerka)、银大马哈鱼 (Oncorhynchus kisutch)、娃鱼（Oncorhynchus tschaw}ftscha)、驼背大马哈鱼 (Oncorhynchus gorbusch曰）大马哈鱼（Oncorhynchus ket曰）、虫工鱼尊（Oncorhynchus m曰sou)7 种鱼类均可W加工成=文鱼罐头。
[0003] 鱼类制品原料品种鉴别成为水产加工行业中面临的重要问题之一，目前国内外市 场上=文鱼W次充好、假冒的现象时有发生，损害了消费者的合法权益和知情权。例如，据 统计国内挪威立文鱼每公斤市场价高达240元，虹縛鱼的市场价格每公斤60元左右，=文鱼 罐头食品标签中仅标注原料为=文鱼，并不标注出=文鱼的具体品种。
[0004] 对于加工肉制品中原料品种鉴别技术，目前常基于对肉制品中特定理化成分的分 析，如蛋白质、脂肪酸等，采用色谱、光谱、电泳等方法识别，运些方法适用于加工程度相对 较低的肉制品，如火腿肠、肉干、肉脯等，对于=文鱼罐头食品，与一般加工肉类食品不同， 其在制作过程中须经过长时间的高溫杀菌处理，一般在118~12rc下处理20~90min，运给 鱼罐头食品中所用原料的品种鉴别带来了困难。
[0005] 细胞色素氧化酶(切tochrome oxidase,C0X)是线粒体内呼吸链电子传递的终末 复合物，是线粒体氧化能力的关键调节物质。细胞色素 C氧化酶亚基I (C0I)是细胞色素 C氧 化酶具有酶催化活性的3个亚基之一。COXI在生物的系统分类W及种类鉴定方面有着广泛、 重要的作用。刘君等人报道了基于线粒体COI的DNA条形码技术在贻贝科种类鉴定中的应用 (水生生物学报，2011,35(5):874-88);梁华芳等人报道了利用COI基因序列对中国沿海龙 邮属8种龙邮进行分子系统学研究（2011);王敏晓等人基于线粒体COXl片段序列对对胶州 湾浮游动物进行了 DNA条形码分析(2011);李新光报道了基于COI的DNA条形码的鱼片（肉） 真伪鉴别技术研究(2013)。
[0006] 在鱼类物种鉴别中，DNA条形码技术是W-段650bp细胞色素 C氧化酶亚基I(COI) 基因序列作为标准序列，从而实现鱼类的快速鉴别。但是对于DNA降解严重的鱼类罐头，DNA 条形码技术可能不能够扩增出适当大小的目的片段，从而导致无法对鱼类品种进行有效鉴 别。
[0007] 为了提高我国鱼类罐头(尤其是=文鱼类罐头)工业产品质量安全水平，规范行业 发展，保护消费者合法权益和知情权，急需能扩增出适当大小的目的片段，从而对鱼类品种 进行有效鉴别的方法。运对于消费者而言，将具有十分重要的现实意义。
【发明内容】
[000引本发明的主要目的是针对=文鱼罐头食品原料标示模糊，现有鉴别分析技术无法 准确鉴别其原料品种的问题，开发一种从S文鱼罐头提取能有效鉴别S文鱼种类的DNA的 方法。
[0009] 本发明的发明人通过优化S文鱼罐头中DNA提取方法，得到适用于PCR扩增的DNA 模板，W细胞色素 C氧化酶亚基I(COI)基因部分序列为目的片段，设计引物扩增出DNA片段 (例如长度212bp大小），进行序列测定，与国际通用DNA数据库，如Genbank中的已有的立文 鱼COI基因序列比对，确定罐头样品中的=文鱼品种。
[0010] -方面，本发明提供了一种从=文鱼罐头中提取DNA的方法，所述方法包括使用含 有CTAB的DNA提取液。
[0011] 优选地，本发明的DNA提取液中含有4 %的CTAB。更优选地，本发明的DNA提取液的 组成为：4%CTAB、100mmol/L Tris-HCUpH 8.0)、1.4mol/L NaCl、20mmol/L 抓 TA(pH 8.0)。
[0012] 任选地，本发明的从=文鱼罐头中提取DNA的方法包括称取一定质量的=文鱼罐 头样品，加入适量氯仿：甲醇:水混合溶液，室溫静置过夜，离屯、，弃上清，并用无菌去离子水 清洗样品。
[0013] 优选地，其中氯仿：甲醇：水混合溶液是氯仿：甲醇：水=1: 2:0.8(体积比）的混合 液。
[0014] 具体而言，本发明的从S文鱼罐头中提取DNA的方法包括如下步骤：
[0015] a):称取一定量的=文鱼罐头样品，加入适量氯仿：甲醇:水混合溶液，室溫静置过 夜，离屯、，弃上清，并用无菌去离子水清洗样品；和
[0016] b)在步骤a)中得到的样品中加入适量DNA提取液，提取S文鱼罐头中DNA。
[0017] 本发明还提供了一种用于从S文鱼罐头中扩增COI的部分基因序列的方法，其包 括：
[0018] a):称取一定量的=文鱼罐头样品，加入适量氯仿：甲醇:水混合溶液，室溫静置过 夜，离屯、，弃上清，并用无菌去离子水清洗样品；
[0019] b)在步骤a)中得到的样品中加入适量DNA提取液，提取S文鱼罐头中DNA;
[0020] C) W步骤b)中获得DNA为模板，进行PCR扩增。
[0021] 在本发明中，扩增COI的部分基因序列所用的引物可W为S文鱼的细胞色素 C氧化 酶亚基I ( C 0 I )基因的部分序列的通用引物对，例如，上游引物序列可为： TGTAAAACGACGGCCAGTTCCACTAATCACAARGAT ATTGGT AC;下游引物序列可为： CAGGAAACAGCTATGACGAAAATCATAATGAAGGCATGAGC。
[0022] 示例性地，所述PCR的扩增条件为：95°C预变性2min;95°C变性lmin，46°C退火 lmin，72°C 延伸 3〇8,5个循环；95°(：变性1111111，53°(：退火1111111，72°(：延伸3〇3,35个循环；721： 延伸5min;反应体系为IOXPCR buffer 2.5化，dNTP 0.2mmol/L，上游引物0.8pmol/L，下游 引物0.8pmol/L，DNA模板200ng，Taq酶1.5U，用d地2〇将总体积补充至化化。
[0023] 本发明进而提供了鉴别=文鱼罐头中=文鱼品种的方法，其包括如下步骤：
[0024] (I)从S文鱼罐头制品中提取DM, W得到适于PCR扩增的DNA模板；
[0025] (2) W步骤(1)中提取的DNA为模板，对细胞色素 C氧化酶亚基I(COI)基因部分序列 进行PCR扩增，W扩增出DNA片段(优选为长度100-5(K)bp，更优选150-25化P，最优选21化P大 小）；
[0026] (3)对步骤(2)中扩增出的DNA片段进行测序并将所测得的DNA序列与已知的S文 鱼品种的COI基因序列进行比对，并确定该=文鱼罐头中的=文鱼品种。
[0027] 任选地，步骤(3)中的比对是通过将所测定的COI基因的部分序列与DNA数据库(如 Genbank)中的已有的S文鱼COI基因序列比对。优先地，所述比对是通过Blast比对。
[0028] 通过本发明的扩增方法所扩增的产物可用于鉴别=文鱼罐头中=文鱼品种中，其 包括如下步骤:测序所扩增的序列W及将所测序的序列与已知的S文鱼品种的COI基因序 列进行比对，并确定该=文鱼罐头中的=文鱼品种。
[0029] 作为一个非限制性的实施方式，利用本发明的方法所提取或扩增的DNA可用于鉴 别=文鱼罐头中=文鱼品种，例如，可W通过如下步骤：
[0030] a):称取一定质量的=文鱼罐头样品，加入适量氯仿：甲醇:水混合溶液，室溫静置 过夜，离屯、，弃上清，并用无菌去离子水清洗样品；
[0031] b):在步骤a)中得到的样品中加入适量DNA提取液(如上述的DNA提取液），提取S 文鱼罐头中DNA;
[0032] C): W步骤b)中得到的DNA为模板，W细胞色素 C氧化酶亚基I(COI)基因部分序列 为目的片段，采用微条形码引物扩增，得到片段大小为212bp的DNA片段，上游引物序列： TGT AAAA CGACGGCCAGTTC CA CTAAT CACA ARGATATTGGTAC，下游引 物序列： CAGGAAACAGCTATGACGAAAATCATAATGAAGGCATGAGC。
[0033] (1):?〇?扩增条件为95。(：预变性2111111;95。(：变性1111111，46。(：退火1111111，72。(：延伸303， 5个循环;95°C变性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸3〇3,35个循环;72°(：延伸5111111;反应体系 为IOXPCR buffer 2.5化，dNTP 0.2mmol/L，上游引物0.8pmol/L，下游引物0.8pmol/L，DNA 模板20化g Jaq酶1.抓，用dd出明尋总体积补充至化化。
[0034] e):将步骤d)中扩增得到的DNA片段进行序列测定，并将序列在Genbank中进行 Blast比对，确定S文鱼品种。
[0035] 优选地，本发明所述的氯仿：甲醇：水混合溶液是氯仿：甲醇：水=1: 2 :0.8 (体积 比）的混合液。
[0036] 本发明针对罐头中DNA降解严重，PCR反应容易失败的情况，WCOI部分序列（微条 形码)作为目的片段，同时优化了S文鱼罐头中DNA的提取方法，能够准确可靠的得到S文 鱼罐头中=文鱼的具体品种信息，其优点在于操作简便易行，操作流程易于实现标准化。
【附图说明】：
[0037] 图1显示了 4 % CTAB提取液和2 % CTAB提取液对DNA提取效果的影响。
[0038] 图2是针对=文鱼罐头进行引物筛选W扩增分别是2^bp、358bp和47化P的目的片 段的结果，其中：图2A是212bp目的片段扩增结果；图2B是358bp目的片段扩增结果；W及图 2C是472bp目的片段扩增结果。
【具体实施方式】：
[0039] 为了更好的理解本发明，下面结合具体实例对本发明进一步说明。
[0040] 实施例：
[0041] 1.样品采集从市面采集不同加工方式的=文鱼罐头样品，如蒲烧、水浸、油浸等。 [00创 2. DNA提取
[0043] a)称取1 OOmgS文鱼罐头肌肉组织样品于2mL离屯、管中，加入ImL氯仿：甲醇：水= 1:2:0.8(体积比），室溫静置过夜，500化pm离屯、3min，弃上清，无菌去离子水清洗样品，样品 组织于-40°C保存备用；
[0044] b)将步骤a)得到样品，无菌条件下剪碎后加入ImL DNA提取液，提取液组成为4% CTAB、100mmol/L Tris-HCl(抑 8.0)、1.4mol/L NaCl、20mmol/L 抓TA(pH 8.0)，置于65°C 恒溫水浴槽中，溫育I-化，期间不时颠倒混匀，直至样品完全消化;溫育后，离屯、取上清液至 一新的2mL离屯、管中，加等体积的氯仿：异戊醇= 24:1(体积比）溶液缓慢震荡至乳白色， 1200化/min离屯、IOmin;重复上述步骤一次;取上清液加2/3体积预冷的异丙醇沉淀DNA，-20 °C，比;离屯、弃上清液，加入80化L 70%乙醇进行洗涂两次，然后弃去乙醇，干燥，沉淀用50y L无菌dd出0溶解，-20°C保存。
[0045] 3. PCR 扩增
[0046] 采用微条形码引物对提取的DNA进行PCR扩增，上游引物序列： TGT AAAA CGACGGCCAGTTC CA CTAAT CACA ARGATATTGGTAC，下游引 物序列： CAGGAAACAGCTATGACGAAAATCATAATGAAGGCATGAGC，目的片段大小为21 化P。
[0047] PCR 扩增条件为 95°C 预变性2min;95°C 变性 1111111，46°(：退火1111111，72°(：延伸3〇3,5个 循环;95°C变性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸3〇3,35个循环;72°(：延伸5111111;反应体系为10 X PCR buf f er2.5化，dNTP 0.2mmo 1 /L，上游引物0. Spmo 1 /L，下游引物0. Spmo 1 /L，DNA模板 200ng，Taq酶1.抓，用d地2〇将总体积补充至化化。
[0048] 4.将扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测后，并送往测序公司测序，运用NCBI的 BLAST程序，把所有样品的PCR产物测序结果与GenBank数据库中已有S文鱼COI基因序列进 行比较，确认=文鱼品种，比对结果见表1。
[0049] 表1=文鱼罐头中=文鱼品种鉴别结果
[(K)加 ]
[0051 ] 对比实施例1:关于DNA提取说明
[0052]采用四种DNA提取方法针对不同加工类型的S文鱼罐头进行DNA提取。分别是如实 施例1的CTAB法W及常规的SDS法、脈盐法、试剂盒法，W不同片段长度引物进行扩增，W扩 增的结果(能否顺利扩增为依据)判断DNA提取方法的优劣。
[0化3]四种DNA提取方法PCR扩增结果汇总
[0化4]
[0化5] +:扩增良好，未扩增出
[0056]从扩增结果来看，4种提取方法均能得到123bp的目的片段，当目的片段增大到 224bp时，CTAB法能够扩增绝大多数样品，所WCTAB法为最优的方法。
[0化7] 对比实施例2:关于CTAB法的优化
[0058] 根据实施例1的方法，采用不同系列浓度的CTAB对S文鱼罐头进行DNA提取。结果 发现，4 % CTAB的提取效果最佳。示例性地，图1显示了 4 % CTAB提取液和2 % CTAB提取液对 DNA提取效果的影响。其中左侧的1-7泳道对应于4 %CTAB提取液；右侧的泳道对应于2 % CTAB提取液。
[0059] 对比实施例3:关于目的片段的选择
[0060] 尽管能从=文鱼罐头中获得123bp的目的片段(如上述实施例中的表1所示），但根 据研究结果，基于123bp并不能鉴定到种水平，只能到属(下表）。
[0061 ] S文鱼罐头商品原料品种鉴定 [00621
[0063] 因此需要获得更大的片段。针对=文鱼罐头进行引物筛选W扩增分别是212bp、 358bp和47化P的目的片段，扩增结果如图2A-图2C:其中图2A是212bp目的片段扩增结果；图 2B是358bp目的片段扩增结果；W及图2C是472bp目的片段扩增结果。
[0064] 根据电泳结果，发现在当目的片段为212bp时，所有样品均能获得较好的扩增，并 且基于该片段的测序分析能够将=文鱼罐头鉴定至种水平。
[0065] 最后应当说明的是，W上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参 照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可W对发明的 技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在 本发明的权利要求范围内。
【主权项】
1. 一种从三文鱼罐头中提取DNA的方法，其包括使用含有CTAB的DNA提取液。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA提取液中含有4 %的CTAB。3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA提取液的组成为：4 % CTAB、1 OOmmo 1 /L Tris-HCl(pH 8.0)、1.4mol/L NaCl、20mmol/L EDTA(pH 8.0)。4. 根据权利要求3所述的方法，其包括称取一定质量的三文鱼罐头样品，加入适量氯 仿：甲醇:水混合溶液，室温静置过夜，离心，弃上清，并用无菌去离子水清洗样品。5. 根据权利要求4所述的方法，其中氯仿：甲醇:水混合溶液是氯仿：甲醇:水=1: 2:0.8 (体积比）的混合液。6. -种扩增三文鱼罐头中细胞色素 C氧化酶亚基I(COI)基因的部分序列的方法，其包 括以权利要求1-5中任一项所述的方法提取的DNA为模板进行PCR扩增。7. 根据权利要求6所述的方法，其中扩增所用的引物对序列如下：上游引物序列： TGTAAAACGACGGCCAGTTCCACTAATCACAARGATATTGGTAC;下游引物序列： CAGGAAACAGCTATGACGAAAATCATAATGAAGGCATGAGC〇8. 根据权利要求6所述的方法，其中PCR扩增的条件为：95 °C预变性2min ; 95 °C变性 111^11，46°(：退火1111丨11，72°(：延伸3〇8,5个循环；95°(：变性1111丨11，53°(：退火1111丨11，72°(：延伸3〇8， 35个循环；72°C延伸5min;反应体系为 10XPCR buffer 2.5yL，dNTP 0.2mmol/L，上游引物 0 · 8pmol/L，下游引物0 · 8pmol/L，DNA 模板200ng，Taq酶 1 · 5U，用ddH20将总体积补充至 25yL。9. 根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述细胞色素 C氧化酶亚基I(COI)基因 的部分序列的大小为212bp。10. 根据权利要求6-9中任一项所述的方法所扩增的产物在鉴别三文鱼罐头中三文鱼 品种中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK105838708SQ201610282830
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】孟镇, 仇凯, 钟其顶, 安丽艳, 杨彤辉
【申请人】中国食品发酵工业研究院