专利名称：一种用于Southern杂交分析的中华绒螯蟹血液DNA提取方法
技术领域：
本发明涉及一种用于Southern杂交分析的中华绒螯蟹血液DNA提取方法，是对动 物的DNA提取。
背景技术：
Southern杂交(Southern Blotting)分子生物学的经典实验方法。其基本原理是 将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序 列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品 中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。中华绒螯蟹是我国特有的水生经济动物，在长期的进化过种中，已形成了不同的 地理种群，如辽河种群、黄河种群、长江种群、瓯江种群及闽江种群等。在养殖过程中，区分 不同种质来源的中华绒螯蟹仅凭外部形态特征，具有较强的主观性，这极容易导致中华绒 螯蟹的种群混杂，资源衰退。在中华绒螯蟹的种质鉴定方面，目前从RAPD，mtDNA, rDNA方面已做了一些研究， 但通过southern杂交来鉴定不同地理种群的中华绒螯蟹的研究还未见报道。而中华绒螯 蟹血液呈淡青色，根据血细胞有无颗粒和颗粒大小、染色特性、折光性以及形成方式、通常 分为四种类型无颗粒细胞、小颗粒细胞、大小颗粒细胞中间型细胞和大颗粒细胞。这与大 部分鱼类血细胞的组成分式明显不一样，其DNA提取方式也存在着明显的差别。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中的不足，从而提供一种用于Southern杂交分析 的中华绒螯蟹血液DNA提取方法，为中华绒螯蟹的种质鉴定提供一种高效可行的分子技术 途径，抽提的DNA浓度较高，能满足Southern杂交方法。按照本发明提供的技术方案，一种用于Southern杂交分析的中华绒螯蟹血液DNA 提取方法，采用以下提取步骤(1)、将一次性3ml注射器吸取A⑶抗凝剂0.5ml，针尖直接从用酒精擦净的中华绒 螯蟹步足基部关节的软膜处插入，深度为0. 35 0. 45cm，吸取Iml的血液，随即取出注射 器，吸入空气并上、下颠倒，使A⑶抗凝剂与Iml的血液充分混勻为混合液；(2)、取下针头，将混合液缓慢地注入1. 5ml离心管中离心分离，离心速度2000 3000转/分钟，离心5 10分钟；(3)、离心结束，去除上清液，留血细胞沉淀；(4)、将血细胞沉淀悬浮于0. 6ml裂解液中混合为混合液；(5)、将混合液置于55°C水浴中1 2小时，不时旋转混合液；(6)、将混合液冷却至室温，在混合液中加入0. 6ml Tris饱和酚，摇勻后离心分离， 离心速度10000 12000转/分钟，离心10 15分钟，取上清液0. 5ml ；
(7)、在上清液中加入0. 5ml氯仿，摇勻后离心分离，离心速度10000 12000转/ 分钟，离心10 15分钟，取上清液0. 4ml ；(8)、在0. 4ml上清液中加入0. 2ml的醋酸铵和0. 8ml无水乙醇，摇勻后离心分离， 离心速度10000 12000转/分钟，离心10 15分钟，收集DNA ；(9)、将收集的DNA用Iml 70%乙醇洗2次，风干，加入20 30 μ ITCBuffer，55°C 溶解12 14小时。本发明中所述的裂解液由十二烷基肌氨酸钠、蛋白酶K、二水乙二胺四乙酸二钠、 去离子水混合组成。0. 6ml裂解液中含有1. 8 6mg十二烷基肌氨酸钠；0. 12mg蛋白酶K ； 11. 17mg 二水乙二胺四乙酸二钠；其余为去离子水。所述醋酸铵浓度为lOmol/L。本发明的中华绒螯蟹裂解液，将常规DNA抽提方法中的十二烷基硫酸钠换成十二 烷基肌氨酸钠，并将其浓度调整为5mg/ml。抽提的DNA浓度较高，能满足Southern杂交方法。另外，为了获得质量较高的中华绒螯蟹DNA，本发明取用新鲜的血液样品，并加入 ACD抗凝剂，并通过离心收集细胞沉淀。在步骤4中，裂解液迅速加入，并使细细胞重新悬浮。
图1为采用本发明方法提取的中华绒螯蟹血液DNA电泳分析照片图2为采用本发明方法提取的中华绒螯蟹血液DNA的Southern杂交照片
具体实施例方式实施例一本发明一种用于Southern杂交分析的中华绒螯蟹血液DNA提取方法采用以下工 艺步骤中华绒螯蟹从无锡中桥市场购买。将一次性3ml注射器吸取ACD抗凝剂0. 5ml，针 尖直接从用酒精擦净的中华绒螯蟹步足基部关节的软膜处插入，深度为0. 35cm，吸取Iml 的血液，随即取出注射器，吸入少量空气并上、下颠倒，使A⑶抗凝剂与血液充分混勻。取下 针头，将混合液缓慢地注入1. 5ml离心管中，离心速度2000转/分钟，离心10分钟，离心结 束，去除上清液，留血细胞沉淀。迅速加入0.6ml裂解液中，使将沉淀悬浮。裂解液由十二 烷基肌氨酸钠、蛋白酶K、二水乙二胺四乙酸二钠、去离子水混合组成，0. 6ml裂解液中含有 1. 8mg十二烷基肌氨酸钠；0. 12mg蛋白酶K;ll. 17mg 二水乙二胺四乙酸二钠；其余为去离 子水。将混合液置于55°C水浴中1小时，不时旋转混合液。将溶液冷却至室温，加入0.6ml Tris饱和酚，摇勻后离心分离，离心速度10000转/分钟，离心15分钟，取上清液0. 5ml。 在0. 5ml上清液中加入0. 5ml的氯仿，摇勻后离心分离，离心速度10000转/分钟，离心15 分钟，取上清液0. 4ml。在0. 4ml上清液中加入0. 2ml 10mol/L醋酸铵和0. 8ml无水乙醇， 摇勻后离心分离，离心速度10000转/分钟，离心10分钟，收集DNA。将收集的DNA用Iml 70%乙醇洗2次，风干，加入20 μ 1 TE Buffer，置于55°C水浴中溶解12小时。实施例二
本发明一种用于Southern杂交分析的中华绒螯蟹血液DNA提取方法采用以下工 艺步骤中华绒螯蟹从无锡中桥市场购买。将一次性3ml注射器吸取ACD抗凝剂0. 5ml，针 尖直接从用酒精擦净的中华绒螯蟹步足基部关节的软膜处插入，深度为0. 4cm，吸取Iml的 血液，随即取出注射器，吸入少量空气并上、下颠倒，使抗凝剂与血液充分混勻。取下针头， 将混合液缓慢地注入1. 5ml离心管中，离心速度3000转/分钟，离心5分钟，离心结束，去 除上清液，留血细胞沉淀。迅速加入0.6ml裂解液中，使将沉淀悬浮。0.6ml裂解液中含有 3mg十二烷基肌氨酸钠；0. 12mg蛋白酶K;ll. 17mg 二水乙二胺四乙酸二钠；其余为去离子 水，使将沉淀悬浮。将混合液置于55°C水浴中1.5小时，不时旋转混合液。将溶液冷却至 室温，加入0. 6ml的Tris饱和酚。摇勻后离心分离，离心速度12000转/分钟，离心10分 钟，取上清液0. 5ml。在上清液中加入0. 5ml的氯仿，摇勻后离心分离，离心速度12000转 /分钟，离心10分钟，取上清液0. 4ml。在上清液中加入0. 2ml 10mol/L醋酸铵和0. 8ml无 水乙醇，摇勻后离心分离，离心速度12000转/分钟，离心10分钟，收集DNA。将收集的DNA 用Iml 70%乙醇洗2次，风干，加入25μ 1 TE Buffer，置于55°C水浴中溶解13小时。实施例三本发明一种用于Southern杂交分析的中华绒螯蟹血液DNA提取方法采用以下工 艺步骤中华绒螯蟹从无锡中桥市场购买。将一次性3ml注射器吸取ACD抗凝剂0. 5ml，针 尖直接从用酒精擦净的中华绒螯蟹步足基部关节的软膜处插入，深度为0. 45cm，吸取Iml 的血液，随即取出注射器，吸入少量空气并上、下颠倒，使抗凝剂与血液充分混勻。取下针 头，将混合液缓慢地注入1. 5ml离心管中，离心速度2500转/分钟，离心10分钟，离心结 束，去除上清液，留血细胞沉淀。迅速加入0.6ml裂解液中，使将沉淀悬浮。0.6ml裂解液 中含有6mg十二烷基肌氨酸钠；0. 12mg蛋白酶K;ll. 17mg 二水乙二胺四乙酸二钠；其余为 去离子水。将混合液置于55°C水浴中2小时，不时旋转混合液。将溶液冷却至室温，加入 0.6ml Tris饱和酚，摇勻后离心分离，离心速度12000转/分钟，离心10分钟，取上清液 0.5ml。在上清液中加入0.5ml的氯仿，摇勻后离心分离，离心速度12000转/分钟，离心 10分钟，取上清液0. 4ml。在上清液中加入0. 2ml 10mol/L醋酸铵和0. 8ml无水乙醇，摇勻 后离心分离，离心速度12000转/分钟，离心10分钟，收集DNA。将收集的DNA用Iml 70% 乙醇洗2次，风干，加入22 μ 1 TE Buffer，置于55°C水浴中溶解14小时。图中M 分子量标准S: DNA 样品Southern 杂交用本发明方法提取的DNA，和特异的探针进行Southern杂交。Southern杂交的具 体方法如下1)取中华绒蟹DNA酶切，于一定浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳。2)通过半干转印系统(Bio-Rad公司)，将DNA转移到带正电荷的尼龙膜上(Roche 公司)。3)通过紫外交联仪(Hybri gene公司)用一定强度的紫外线将已转移的DNA与膜交联。4)将适量的预杂交液DIG Easy Hyb (Roche公司)在42°C预热。放入印迹膜，在 42°C预杂交30分钟。5)水煮地高辛标记的探针5分钟使变性，并立即放在冰上2分钟。加适量的探针 到已预热的杂交液中，混合均勻。42°C杂交至少4小时或过夜。6)用25mL的2X SSC, 0. 1 %十二烷基硫酸钠在室温摇动洗膜2次，每次5分钟。7)用已预热的30mL 0. 5XSSC，0. 十二烷基硫酸钠在65°C摇动洗膜2次，每次 15mi η。8)免疫检测用IOmL冲洗液洗膜1-5分钟；膜在15mL阻断液中孵育30分钟；膜 和8mL抗体孵育30分钟；在15mL冲洗液中洗膜2次，每次15分钟；在15mL检测液中平衡 2-5分钟。用本发明方法提取的DNA，获得了高纯度的中华绒螯蟹血液DNA，和特异的探针进 行Southern杂交。结果显示杂交信号较强，无杂带现象，为下一步通过Southern杂交来鉴 定不同地理种群的中华绒螯蟹奠定了基础。见图2。图中C 对照样品S: DNA 样品。
权利要求
一种用于Southern杂交分析的中华绒螯蟹血液DNA提取方法，其特征是采用以下提取步骤(1)、将一次性3ml注射器吸取ACD抗凝剂0.5ml，针尖直接从用酒精擦净的中华绒螯蟹步足基部关节的软膜处插入，深度为0.35～0.45cm，吸取1ml的血液，随即取出注射器，吸入空气并上、下颠倒，使ACD抗凝剂与1ml的血液充分混匀为混合液；(2)、取下针头，将混合液缓慢地注入1.5ml离心管中离心分离，离心速度2000～3000转/分钟，离心5～10分钟；(3)、离心结束，去除上清液，留血细胞沉淀；(4)、将血细胞沉淀悬浮于0.6ml裂解液中混合为混合液；(5)、将混合液置于55℃水浴中1～2小时，不时旋转混合溶液；(6)、将混合溶液冷却至室温，在混合液中加入0.6ml的Tri s饱和酚，摇匀后离心分离，离心速度10000～12000转/分钟，离心10～15分钟，取上清液0.5ml；(7)、在上清液中加入0.5ml的氯仿，摇匀后离心分离，离心速度10000～12000转/分钟，离心10～15分钟，取上清液0.4ml；(8)、在上清液中加入0.2ml的醋酸铵和0.8ml的无水乙醇，摇匀后离心分离，离心速度10000～12000转/分钟，离心10～15分钟，收集DNA；(9)、将收集的DNA用1ml 70％乙醇洗2次，风干，加入20～30μl TEBuffer，置于55℃水浴中溶解12～14小时。
2.如权利要求1所述的一种用于Southern杂交分析的中华绒螯蟹血液DNA提取方 法，其特征是所述0. 6ml裂解液中含有1. 8 Gmg十二烷基肌氨酸钠、0. 12mg蛋白酶K、 11. 17mg 二水乙二胺四乙酸二钠，其余为去离子水。
3.根据权利要求1所述的用于Southern杂交分析的中华绒螯蟹血液提取方法，其特征 是所述第二步骤中收集血细胞的离心速度为3000转/分钟，离心5分钟。
4.如权利要求1所述的一种用于Southern杂交分析的中华绒螯蟹血液DNA提取方法， 其特征是所述醋酸铵浓度为10mol/L。
全文摘要
本发明涉及一种用于Southern杂交分析的中华绒螯蟹血液DNA提取方法，特征是采用以下提取步骤将注射器吸取ACD抗凝剂，在中华绒螯蟹步足基部关节的软膜处插入，吸取血液，使ACD抗凝剂与血液充分混匀为混合液；经离心去除上清液，留血细胞沉淀；将血细胞沉淀悬浮于裂解液中混合为混合液；在混合液中加入Tris饱和酚，摇匀后离心分离；在上清液中加入氯仿，摇匀后离心分离，取上清液；在上清液中加入醋酸铵和无水乙醇，摇匀后离心分离，收集DNA；用70％乙醇洗后，风干，溶解。本发明抽提的DNA浓度较高，能满足Southern杂交方法。
文档编号C12N15/10GK101886072SQ20101023082
公开日2010年11月17日 申请日期2010年7月14日 优先权日2010年7月14日
发明者俞菊华, 唐永凯, 尤洋, 徐跑, 李建林, 李红霞 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心