一种养殖虾蟹的抗病性状评估方法
【专利摘要】一种养殖虾蟹的抗病性状评估方法，属于水产养殖技术领域，按养殖虾蟹的肌肉重量比例分别感染等量病原，测定养殖虾蟹病原清除力、血细胞数、血蓝蛋白含量、血浆AKP活力、ALF、crustin、lysozyme、cathepsin B和LGBP 9个指标，用主成分分析法计算得到感染对象的抗病指数f，f值越大说明抗病性状越强，f值越小说明抗病性状越弱；本发明针对本领域无类似技术而构建了一套适用的综合评价养殖虾蟹抗病性状指数，使评价结果更准确，克服了单项免疫指标评判抗病性状的局限性与不确定性。
【专利说明】
一种养殖虾蟹的抗病性状评估方法
技术领域
[0001] 本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种养殖虾蟹的抗病性状评估方法。
【背景技术】
[0002] 虾蟹类养殖年产量近400万吨，在我国水产养殖中占有重要地位。养殖虾类主要包 括海水的凡纳滨对虾、斑节对虾、中国明对虾、日本囊对虾以及淡水的青虾、罗氏沼虾和克 氏原螯虾等。养殖蟹类主要包括海水的三疣梭子蟹、拟穴青蟹以及淡水的中华绒螯蟹等。
[0003] 细菌和病毒是在虾蟹养殖中危害最大的两类传染性病原，可引起虾蟹疾病爆发， 造成巨大经济损失。其中，细菌中的弧菌是最为常见的致病菌，多属于条件致病菌，即当水 质环境恶化时，其中的微生物多样性下降，某一致病性弧菌将成为优势种群，从而引起疾病 爆发。常见的危害奸蟹健康的致病性弧菌主要有副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、 暢弧菌（Vibrio anguill arum)、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi)和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus)等。危害4下类的病毒有对4下白斑综合症(White spot syndrome，WSS)、黄头 病(Yellow head disease,YHD)、桃拉病毒综合症(Taura syndrome,TS)、传染性皮下及造 血组织坏死（Infectious hysoaermal and hematopoietic necrosis,ΙΗΗΝ)、河蟹颤抖病、 蓝蟹疱疹状病毒病等。
[0004]与其他无脊椎动物一样，甲壳动物体内缺乏抗体介导的获得性免疫反应，因此其 免疫防御主要依赖于先天免疫系统。甲壳动物的先天免疫系统主要包括物理防御，体液免 疫和细胞免疫，这三个免疫过程相辅相成，密切相关。作为无脊椎动物先天免疫防御的重要 组成，体液免疫主要是指机体识别异物，经过一系列的胞外级联反应传递信号，诱导免疫细 胞产生或释放一些免疫因子以抵御外源物质入侵。这些因子主要包括各类模式识别受体、 血凝因子、细胞激活因子、抗菌抗病毒因子、抗氧化因子以及酚氧化酶、溶菌酶、酸性磷酸 酶、碱性磷酸酶等具有免疫酶活性的因子等，起到直接杀灭病原体或识别异物、抑制病原菌 的繁殖和扩散等作用。
[0005] 抗病性状主要是指能用来反映机体对疾病的防御功能和免疫应答能力。其中非特 异性抗病力不限于某一种病原体，它受多基因和环境的综合影响，病原体的抗原性差异对 一般抗病力影响极小，甚至根本没有影响，这种抗病性状体现了机体对疾病的整体防御功 能，如免疫系统对抗原的免疫应答反应。由于甲壳动物的免疫系统属于非特异性免疫系统， 无法根据某一特定的疾病或病原体产生抗性，不具备参与特殊抗原反应的抗体。因此甲壳 动物的抗病性状属于非特异性抗病力。
[0006] 目前，疾病爆发后或者直接活体攻毒后的累计死亡率或存活率是判断甲壳动物抗 病性状高低的最直观准确的指标。但是该方法所需活体数量较多，且无法反映虾蟹体内的 免疫应答情况。因此，有研究使用血细胞相关的指标(血细胞数、抗菌力、吞噬率等)及各种 免疫因子的活性水平(1^1、？0、500^0?^即等免疫酶活力)等来评价虾蟹抗病性状。随着分 子生物技术的发展，越来越多的免疫相关基因的也被鉴定出来并作为评价抗病性状的指 标，如ALF、crust in、toll、LGBP等。但是这些指标往往在不同的物种或者同一物种不同状态 下，测定值也有较大差别。另一方面测试指标杂多，功能不明确，使用单一或少数几个免疫 指标评价养殖虾蟹的抗病性能具有一定的盲目性和不确定性，无法综合反映机体的抗病 性状。因此筛选出一套能综合反映甲壳动物抗病性状的评估方法，对于抗病育种和养殖品 种筛选等具有重要的应用价值。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题在于提供一种养殖虾蟹的抗病性状评估方法，以解决我 国养殖虾蟹抗病性状评估指标不明确的问题。
[0008] 本发明是按以下操作程序完成的：
[0009] -种养殖虾蟹的抗病性状评估方法，按养殖虾蟹的肌肉重量比例分别感染等量病 原，设置对照组，于感染后lh取各物种肝胰腺用于机体内病原含量测定，以得到感染对象的 病原清除力；感染后24h取血淋巴和肝胰腺用于血细胞数、血蓝蛋白含量、血浆AKP活力及 ALF、crust in、lysozyme、catheps in B、LGBP5个免疫基因指标的测定，将病原清除力、血细 胞数、血蓝蛋白含量、血衆41^活力、41^、(31'1181：；[11、1780250116、031：116。8；[1113和1^1^9个指标 的数值进行标准化后，用主成分分析法计算得到感染对象的抗病指数f，f值越大说明抗病 性状越强，f值越小说明抗病性状越弱；
[0010] f = 0 · 32*Ζχι+0 · 34*Ζχ2+0 · 23*Ζχ3+0 · 28*Ζχ4+0 · 32*Ζχ5+0 · 30*Ζχ6+0 · 15*Zx7+0 · 24* Zx8+0.30*Zxg
[0011] 其中，ZX1-ZX9分别表示标准化后的病原清除力、血细胞数(THC)、血蓝蛋白含量 (HEM)、血浆AKP活力、肝胰腺ALF基因表达、肝胰腺crustin基因表达、肝胰腺lysozyme基因 表达、肝胰腺cath印s in B基因表达及血细胞LGBP基因表达。
[0012] 进一步，所述的病原清除力的测定方法:感染对象感染病原lh后取肝胰腺无菌取 样称重，加 PBS缓冲液研磨，用平板计数法计算感染对象体内细菌数量或用绝对定量PCR方 法测定感染对象体内病毒含量。
[0013] 进一步，所述的血细胞数的测定方法:采用血球计数板在光学显微镜下直接计数。
[0014] 进一步，所述的血蓝蛋白含量的测定方法:感染对象感染病原24h后取血淋巴液， 离心取血衆样品，加入双蒸水混勾，335nm下测吸光值，计算公式为 ：E335nm(mM) = 17.26 X O.D. 335 〇
[0015] 进一步，所述的血衆AKP活力的测定方法:感染对象感染病原24h后取血淋巴液，离 心1后取血浆样品，按照AKP试剂盒的说明进行。
[0016] 进一步，所述的41^、(^1181:;[11、15^0250116、031:116。8；[1113、1^1^基因表达量的测定方 法：感染对象感染病原24h后取肝胰腺用实时荧光定量PCR方法检测ALF、crust in、 lysozyme、cath印sin B基因表达量;取血淋巴液，离心后检测血细胞LGBP基因表达量。
[0017] 本发明与现有技术相比的有益效果：
[0018] 与其他评价方法相比，本发明针对本领域无类似技术而构建了一套适用的综合评 价养殖虾蟹抗病性状指数，使评价结果更准确，克服了单项免疫指标评判抗病性状的局限 性与不确定性。
【附图说明】
[0019] 图1 4种养殖虾蟹感染相同浓度副溶血弧菌后的累计死亡率。
【具体实施方式】
[0020] 下面通过实施例结合附图来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的保护 范围不受实施例任何形式上的限制。
[0021] 实施例1
[0022] -种养殖虾蟹的抗病性状评估方法，按不同养殖虾蟹的肌肉重量比例分别感染等 量病原，设置对照组，于感染后lh取各物种肝胰腺用于机体内病原含量测定，以得到感染 对象的病原清除力;感染后24h取血淋巴和肝胰腺用于血细胞数、血蓝蛋白含量、血衆AKP活 力及41^、(^1181：；[11、15^0250116、031：116。8；[1113、1^1^5个免疫基因指标的测定，将病原清除力、 血细胞数、血蓝蛋白含量、血楽^1^活力、41^、(31'1181：；[11、17802：71116、0&1：116。8；[1113和1^1^9个 指标的数值进行标准化后，用主成分分析法计算得到养殖虾蟹的抗病指数f，f值越大说明 抗病性状越强，f值越小说明抗病性状越弱；
[0023] f = 0 · 32*Ζχι+0 · 34*Ζχ2+0 · 23*Ζχ3+0 · 28*Ζχ4+0 · 32*Ζχ5+0 · 30*Ζχ6+0 · 15*Zx7+0 · 24* Zx8+0.30*Zx9
[0024] 其中，ZX1-Zx9分别表示标准化后的病原清除力、血细胞数（THC)、血蓝蛋白含量 (HEM)、血浆AKP活力、肝胰腺ALF基因表达、肝胰腺crustin基因表达、肝胰腺lysozyme基因 表达、肝胰腺cath印s in B基因表达及血细胞LGBP基因表达。
[0025] 本实施例所用实验动物分别为凡纳滨对虾、中国对虾"黄海3号"，实验室多年繁育 的脊尾白虾群体，三疣梭子蟹"黄选1号"。各种实验动物分别分为感染组和对照组，每组各6 个平行，其中三个平行用于死亡数记录(记录时间点为311，61 1，1211，2411)，另3个平行用于9个 免疫指标的取样测定。每个平行10尾虾(或4尾蟹）。以10 6CFU/ml副溶血弧菌按肌肉重量注 射感染凡纳滨对虾、中国对虾、脊尾白虾和三疣梭子蟹，注射剂量分别为23，27，10，100yL， 各物种对照组注射等量PBS。于感染后lh取各物种肝胰腺用于细菌含量测定。感染后24h取 血淋巴和肝胰腺用于血细胞数、血蓝蛋白含量、血衆AKP活力及免疫基因指标的测定。
[0026]细菌清除力：4种实验动物的感染副溶血弧菌lh后，在无菌状态下取肝胰腺称重， 加 PBS缓冲液研磨后进行梯度稀释，涂布2216E固体培养基平板，每个梯度样品涂布三个平 板，于28 °C恒温培养箱中培养24h，用平板计数法计算细菌数量。
[0027]血细胞数:采用血球计数板在光学显微镜下直接计数。4种实验动物感染副溶血弧 菌24h后取100yL血淋巴与100yL 10%的甲醛于1.5mL离心管中混匀，固定30min，然后取血 细胞悬液置于血球计数板上，观察计数。如浓度过高，需进行稀释后计数。每个样品三个重 复。
[0028] 血蓝蛋白含量：4种实验动物感染副溶血弧菌24h后取800yL血淋巴液，4°C 4000rpm/min离心10min后取100yL血浆样品，加入900yL双蒸水混匀，335nm下测吸光值。每 个样品三个重复。计算公式为:E335r?(mM) = 17.26 X 0. D. 335。
[0029] 血浆AKP活力:4种实验动物感染副溶血弧菌24h后取800yL血淋巴液，4°C4000rpm/ min离心10min后取100yL血衆样品，按照南京建成生物工程研究所AKP试剂盒的说明进行。 [0030] ALF、crus tin、lysozyme、catheps in B、LGBP 基因表达量:感染副溶血弧菌24h 后取 肝胰腺检测六1^、(31'1181：；[11、15^0271116、031：116。8；[1113基因表达量，取80(^1^血淋巴液，4 <€ 4000rpm/min离心10min后检测血细胞LGBP基因表达量。
[0031] 实验结果
[0032] 表1 4种甲壳动物感染等量副溶血弧菌后各免疫指标测定值 「00331
[0034] 细菌清除力、血细胞数目、血蓝蛋白含量、血浆AKP活性采用实验组相对于空白对 照变化的百分比的形式来表示。基因表达量用目标基因在实验组相对空白对照的相对表达 倍数来表示。9个免疫指标测定值如表1所示。
[0035] 为避免指标量纲的影响，对原始数据进行标准化处理。具体方法是对同一变量减 去其平均值，再除以标准差，使得标准化后的数据变得具有可比性。
[0036] 所用公式为:￥。=(父。-?(」)/5」，（1 = 1，2，"，11;]_ = 1，2，"，口）。
[0037] 其中，为原始变量标准化处理后的值;为第i个样本第j个指标的原始数据;心 为η个样本第j个指标的平均值为样本的标准差。p表示第p个指标。
[0038] 标准化处理后的数据如表2所示：
[0039]表2原始数据标准化
[0040]
[0041 ]注:各指标名称前的Z代表标准化。G表示肝胰腺，X表示血细胞 [0042] SPSS 19.0进行主成分分析，各主成分的特征根及其方差贡献率如表3所示。第一 个主成分特征值为7.192，占特征值总和的79.91 % ;第二个主成分特征值为1.44，占特征值 总和的16.004%，前两个主成分的累计贡献率达95.914% >85%，基本上提取的这两个主 成分就能够较好地反映原有变量的绝大部分信息，因此可以用作构建养殖虾蟹抗病性状综 合评估模型。
[0043]表3各变量的特征根及相应的贡献率
[0044]
[0045] 注:提取方法:主成分分析法
[0046] 计算特征向量矩阵，主成分表达式：
[0047] fl = 0 · 35*Ζχι+0 · 35*Ζχ2+0 · 34*Ζχ3+〇 · 20*Ζχ4+0 · 37*Ζχ5+〇 · 36*Ζχ6+〇 · 29*Zx7+ 0·34*Zx8+0·36*Zxg (1)
[0048] f2 = 0 · 18*Zxi+0 · 27*Zx2-0 · 29*Zx3+0 · 68*Zx4+〇 · 08*Zx5-0 · 52Zx7-0 · 25*Zx8+0 · 02* Zx 9 (2)
[0049] 其中ZX1-ZX9分别为标准化后的细菌清除力、血细胞数(THC)、血蓝蛋白含量(HEM)、 血衆AKP活力、肝胰腺ALF基因表达、肝胰腺crus tin基因表达、肝胰腺lysozyme基因表达、肝 胰腺cath印s in B基因表达及血细胞LGBP基因表达。
[0050] 由于前2个主成分的方差贡献率超过85%，所以用前两个主成分的方差贡献率为 权，计算前2个主成分的加权平均数得出综合加权评分，即抗病性状指数，具体计算公式:f =79.91f 1+16.004f 2/95.914，将f 1和f 2代入即得抗病性状指数f计算公式：
[0051 ] f = 0 · 32*Ζχι+0 · 34*Ζχ2+0 · 23*Ζχ3+0 · 28*Ζχ4+〇 · 32*Ζχ5+0 · 30*Ζχ6+0 · 15*Zx7+0 · 24* Zx 8+0.30*Zx9 (3)
[0052]从抗病性状指数f中不难发现感染副溶血弧菌后细菌清除力、血细胞数（THC)、肝 胰腺ALF基因表达、肝胰腺crust in基因表达、血细胞LGBP基因表达等5个抗病指标对甲壳动 物抗病性状的影响较大。
[0053]分别计算感染副溶血弧菌后的凡纳滨对虾、中国对虾、脊尾白虾和三疣梭子蟹各 抗病指标的第一主成分(Π )、第二主成分(f2)及综合主成分(f)得分进行。从表4可以看出， 4种甲壳动物的抗病性状高低排名为:三疣梭子蟹〉脊尾白虾〉中国对虾〉凡纳滨对虾。
[0054] 表4 4种甲壳动物各主成分及综合主成分得分
[0055]
[0056] 注:表中数据为负值表示低于平均水平
[0057]为了验证以上模型所预测的结果是否准确，对三种甲壳动物进行副溶血弧菌攻 毒，记录累计死亡率，如图1所示。发现当感染浓度为l〇6CFU/ml时，凡纳滨对虾、中国对虾、 脊尾白虾和三疣梭子蟹分别在3h、6h、12h、12h开始出现死亡个体，随后死亡率逐渐升高，至 24h各物种的累计死亡率分别为76.7%、46.7%、16.7%和10%。说明4种养殖虾蟹抗副溶血 弧菌感染的抗病性状大小为:三疣梭子蟹〉脊尾白虾〉中国对虾〉凡纳滨对虾，与抗病力指数 预测结果一致。
【主权项】
1. 一种养殖虾蟹的抗病性状评估方法，其特征在于所述的方法为按养殖虾蟹的肌肉重 量比例分别感染等量病原，于感染后lh取各感染对象肝胰腺用于机体内病原含量测定，以 得到感染对象的病原清除力；感染后24h取血淋巴和肝胰腺用于血细胞数、血蓝蛋白含量、 血衆4即活力及41^、(：1'1181:;[11、15^〇25〇116、〇31:116。8；[1113、1^1^5个免疫基因指标的测定，将病 原清除力、血细胞数、血蓝蛋白含量、血衆4即活力、41^、〇1'1181：；[11、15^025〇116、〇31：116。8；[1113和 LGBP 9个指标的数值进行标准化后，用主成分分析法计算得到感染对象的抗病指数f，f值 越大说明抗病性状越强，f值越小说明抗病性状越弱； f = 0 · 32*Ζχι+0 · 34*Ζχ2+0 · 23*Ζχ3+0 · 28*Ζχ4+0 · 32*Ζχ5+0 · 30*Ζχ6+0 · 15*Ζχ7+0 · 24*Zx8+ 0·30*Zx9 其中，ZX1-ZX9分别表示标准化后的病原清除力、血细胞数、血蓝蛋白含量、血浆AKP活 力、肝胰腺ALF基因表达、肝胰腺crus tin基因表达、肝胰腺lysozyme基因表达、肝胰腺 cath印sin B基因表达及血细胞LGBP基因表达。2. 根据权利要求1所述的一种养殖虾蟹的抗病性状评估方法，其特征在于所述的病原 清除力的测定方法:感染对象感染病原lh后取肝胰腺无菌取样称重，加 PBS缓冲液研磨，用 平板计数法计算感染对象体内细菌数量或用绝对定量PCR方法测定感染对象体内病毒含 量。3. 根据权利要求1所述的一种养殖虾蟹的抗病性状评估方法，其特征在于所述的血细 胞数的测定方法:采用血球计数板在光学显微镜下直接计数。4. 根据权利要求1所述的一种养殖虾蟹的抗病性状评估方法，其特征在于所述的血蓝 蛋白含量的测定方法:感染对象感染病原24h后取血淋巴液，离心取血浆样品，加入双蒸水 混匀，335nm下测吸光值，计算公式为:E 335r?(mM) = 17.26 X 0. D. 335。5. 根据权利要求1所述的一种养殖虾蟹的抗病性状评估方法，其特征在于所述的血浆 AKP活力的测定方法:感染对象感染病原24h后取血淋巴液，离心1后取血浆样品，按照ΑΚΡΗ 剂盒的说明进行。6. 根据权利要求1所述的一种养殖虾蟹的抗病性状评估方法，其特征在于所述的ALF、 crustin、lysozyme、cathepsin B、LGBP基因表达量的测定方法:感染对象感染病原24h后取 肝胰腺用实时焚光定量?〇?方法检测41^、〇10181：；[11、15^0250116、〇31：116。8；[1113基因表达量 ;取 血淋巴液，离心后检测血细胞LGBP基因表达量。
【文档编号】A01K61/00GK106035144SQ201610369767
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】李健, 葛倩倩, 刘萍, 李吉涛
【申请人】中国水产科学研究院黄海水产研究所