专利名称：中华绒螯蟹种质检测和鉴定技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及品质检测领域，更具体地，涉及中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)种质检测和鉴定技术。
背景技术：
中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)，又称河蟹，属节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustaceae)、十足目(Decapoda)、方蟹科(Grapsidae)、绒螯蟹属(Eriocheir)，是我国特有的水生经济动物。在我国，南至北纬24°，北至北纬42°～43°，东至东经124°的鸭绿江口，西至东经112°的湖北沙市，均有分布。
中华绒螯蟹具有丰富的营养。例如，江苏阳澄湖中华绒螯蟹的成蟹的肌肉、肝脏及性腺三大可食部分共占体重的36.72％，壳、鳃、胃及心脏四大非可食部分共占体重的53.26％。另有10.02％为血淋巴和组织液。一、二级商品蟹的雌蟹可食部分各高出雄蟹5.28％和6.55％。雌蟹的脂肪显著高于雄蟹。雄蟹在微量元素和氨基酸组成方面优于雌蟹。
自20世纪70年代末突破人工育苗技术以来，河蟹增养殖业有了长足发展，大多数省市先后开展了人工放流，增养殖效果显著；继而池塘养蟹、稻田养蟹和网围养蟹等有了很大的发展；尤其是20世纪90年代，河蟹增养殖进入了快速发展期。
河蟹人工育苗及养殖的发展，一方面极大地推动了河蟹资源的开发与利用；另一方面，长江、辽河、瓯江等水系间蟹苗出现了前所未有的无序流动，种质不断混杂。种质的混杂已成为当前河蟹养殖生产发展的瓶颈；再加上人工繁殖技术尚不完善，苗种供不应求，致使市场上蟹苗和蟹种以次充好、以假充真的现象非常普遍。
目前的河蟹种质检测和鉴定还主要依赖于肉眼从形态上判别。但不同水系的河蟹在形态上相似，给鉴别带来困难。例如，辽河蟹和长江蟹是市场上最常见的河蟹，占食用河蟹的90％以上。长江蟹的生长速度快于辽河蟹，性成熟时间比辽河蟹晚1个月。但是两者的仔、幼蟹在形态上十分相似，很难区分，因此，常有将辽河蟹苗充作长江蟹苗的情况，因辽河蟹在长江流域生长不及长江蟹，给蟹农造成很大损失。
水产学报第23卷第4期第337-342页(1999年12月)中，公开了根据辽河、黄河、长江、瓯江、珠江及南流江六个水系绒螯蟹群体的32个外部形态特征，进行聚类分析和判别分析。聚类分析将辽河、黄河、长江和瓯江四个北方水系的蟹划为一组，把珠江和南流江两个南方水系的蟹划为另一组。并认为，北方蟹与南方蟹之间的形态差异是亚种以上水平的差异，而北方蟹内部与南方蟹内部各水系之间差异则属不同地理种群间的差异。然而，仅根据外部形态有时仍较难区分同一组中的各类河蟹(例如区分辽河蟹和长江蟹)。
水产学报第23卷第4期第331-336页(1999年12月)中，公开了采用聚丙烯胺凝胶电泳分析比较了上述6个水系的两种绒螯蟹(中华绒螯蟹、日本绒螯蟹)群体间的生化遗传差异。结果发现，(1)辽河、黄河、长江和瓯江中华绒螯蟹群体间的生化遗传差异不显著，属种内群体间差异。(2)珠江和南流江日本绒螯蟹群体间的生化遗传差异也不显著，尚未达到亚种分化水平。(3)辽河、黄河、长江和欧江中华绒蟹与珠江和南流江日本绒螯蟹在SOD同工酶表型上有明显差异，SOD-2位点仅在辽河、黄河、长江和瓯江中华绒螯蟹中表达，而SOD-4位点仅在珠江和南流江日本绒螯蟹中表达，这些可作为中华绒鳌蟹与日本绒鳌蟹群体区分的生化遗传标志。辽河、黄河、长江和瓯江中华绒鳌蟹群体同珠江和南流江日本绒螯蟹群体间的遗传距离较大。(4)聚类分析表明，在我国大陆沿海水系分布的绒鳌蟹可分为两大类群，辽河、黄河、长江和瓯江水系的绒螯蟹属北方类群，即中华绒鳌蟹；珠江和南流江的绒螯蟹属南方类群，即日本绒螯蟹。但该生化遗传分析方法仍然无法有效地区分同一组中的各类河蟹(例如区分辽河蟹和长江蟹)。
因此，研究和保护中华绒螯蟹种质的检测和鉴定技术，对保证我国河蟹养殖业的持续、稳定的发展十分迫切。本领域迫切需要开发尽可有效、准确地鉴别中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的种质检测和鉴定技术，尤其是有效、准确区分辽河蟹和长江蟹的种质检测和鉴定技术。
发明内容
本发明的目的就是提供一种有效、准确地鉴别中华绒螯蟹的种质检测和鉴定技术。
本发明的另一目的是提供有效、准确地鉴别中华绒螯蟹的试剂盒。
在本发明的第一方面，提供了一种河蟹种质检测和鉴定的方法，包括步骤(a)提取河蟹样品的DNA；(b)以步骤(a)的DNA为模板，用引物TGACCCGCCT(SEQ ID NO1)进行PCR扩增，并对扩增产物进行分析，其中，947bp条带的出现频率为80-100％就表明样品是长江蟹，而947bp条带的出现频率为0-20％就表明样品是辽河蟹。
在一优选例中，步骤(b)的PCR的扩增条件包括在DNA变性后，进行35-50个扩增循环(更佳地40-50个扩增循环)，所述的扩增循环中退火温度为39±5℃。
在另一优选例中，步骤(b)的PCR的扩增条件包括在94±2℃变性3-20min，1个循环；94±2℃ 45±15sec，36±2℃ 45±15sec，72±2℃ 90±30sec，40～45个循环；72±2℃延伸3-20min。
在另一优选例中，在所述方法中，947bp条带的出现频率为80-100％就表明样品是长江蟹，而947bp条带的出现频率为0-20就表明样品是辽河蟹。
在另一优选例中，步骤(b)中的分析是电泳分析，且河蟹样品的数量为4-100只。
在另一优选例中，该方法还包括步骤(b′)以步骤(a)的DNA为模板，用引物CTTTCGCTCC(SEQ ID NO2)进行PCR扩增，并对扩增产物进行分析，其中，出现700bp条带表示样品是中华绒螯蟹，不出现700bp条带表示样品是日本绒螯蟹；出现880bp条带表示样品是日本绒螯蟹，不出现880bp条带表示样品是中华绒螯蟹。
在另一优选例中，该方法还包括步骤对河蟹样品进行形态判别分析和生化遗传差异分析。
在本发明的第二方面，提供了一种用于河蟹种质检测和鉴定的试剂盒，它包含(a)引物TGACCCGCCT(SEQ ID NO1)；(b)说明书，所述的说明书中注明，以提取的河蟹样品的DNA为模板，用引物TGACCCGCCT(SEQ ID NO1)进行PCR扩增后，947bp条带的出现频率为80-100％就表明样品是长江蟹，而947bp条带的出现频率为0-20％就表明样品是辽河蟹。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包含(c)提取DNA所需的试剂；(d)PCR反应所需的试剂。
在另一优选例中，所述的试剂盒，还包含(e)引物CTTTCGCTCC(SEQ ID NO2)。
图1显示了用引物1在6群体绒螯蟹(各4个体)的基因组DNA的扩增电泳图。
图2显示了用引物2在6群体绒螯蟹(各4个体)的基因组DNA的扩增电泳图。
图3显示了用引物1扩增的947bp条带在小样本(4个体)各绒螯蟹种群中的出现频率。
图4显示了用引物1扩增的947bp条带在大样本(30个体)各绒螯蟹种群中的出现频率。
图5显示了中华绒螯蟹的4个种群和日本绒螯蟹的2个种群的遗传距离图。
具体实施例方式
本发明人通过对中华绒螯蟹不同种群的形态学、生化遗传学及分子遗传学等各方面长期广泛而深入的综合研究，查明其长江、辽河、瓯江、黄河种群及近缘种日本绒螯蟹的珠江南流江蟹种群在个体、群体及细胞、分子水平等不同层次上的遗传差异。首次建立了不同种群绒螯蟹从幼蟹到成蟹的量化判别函数，找到了中华绒螯蟹有别于其它绒螯蟹的生化遗传标记和分子遗传标记，以及中华绒螯蟹不同种群的分子遗传渐变标记；尤其是找到了区分长江蟹和辽河蟹的有效的分子遗传标记，在此基础上从而建立了从形态、生化遗传和分子遗传等方面鉴别中华绒螯蟹不同种群，以及把它们同其它绒螯蟹属内其它种蟹予以区别的一套较为完整、行之有效的方法与技术。
随机扩增多态DNA(RAPD)技术是一种利用短引物，对基因组DNA进行扩增，然后观察扩增条带多态性(即指纹标记)的技术。为了建立基于RAPD的分子遗传标记，其技术的关键是确定引物以及确定扩增条件。尤其是在使用一种引物(单引物)的情况下，扩增条件的变化对结果影响很大。本发明人对使用单引物扩增的条件进行了优化，并确定了有效的扩增引物，从而确定了区分长江蟹和辽河蟹的有效的分子遗传标记。
在一实施例中，本发明人采用RAPD技术，用48个具有丰富多态性的10碱基随机引物对辽河、黄河、长江、瓯江的中华绒螯蟹和珠江、南流江的日本绒螯蟹，共6个群体，进行RAPD分析。发现(1)两个引物具有种群特异性带，其中CTTTCGCTCC(SEQ ID NO2)扩增的880bp片段为珠江蟹和南流江蟹群体中所特有，而700bp片段为长江蟹、辽河蟹、黄河蟹和瓯江蟹所特有，可作为区别日本绒螯蟹和中华绒螯蟹的分子遗传标记。
(2)TGACCCGCCT(SEQ ID NO1)扩增的947bp片段的出现频率，在长江、黄河、辽河群体显著地从南到北递减，依次为长江蟹(87.50％)＞黄河蟹(41.66％)＞辽河蟹(10.83％)，这一遗传渐变的度量可作为区别这三个水系的中华绒螯蟹种群的判据。(3)6水系群体内的平均遗传相似度依次为辽河蟹(0.908)＞南流江蟹＞(0.897)＞瓯江蟹(0.895)＞珠江蟹(0.895)＞黄河蟹(0.890)＞长江蟹(0.850)；6群体间遗传距离及其UPGMA、NJ聚类分析进一步表明，南方的南流江蟹、珠江蟹同北方的长江蟹、辽河蟹及黄河蟹在基因组之间存在明显的歧化。
本发明的用于区分长江蟹和辽河蟹的引物为TGACCCGCCT(SEQ ID NO1)。用于区分中华绒螯蟹和日本绒螯蟹的引物是CTTTCGCTCC(SEQ ID NO2)(利用700bp条带)。用于区分“珠江蟹和南流江蟹”和“长江蟹、辽河蟹、瓯江蟹、黄河蟹”的引物是CTTTCGCTCC(SEQ ID NO2)(利用880bp条带)。
本发明的方法中，包括了用上述引物对抽提的河蟹DNA进行扩增的步骤。除了最初的变性和最后的延伸之外，本发明的PCR扩增通常可包括两个阶段(1)模板形成阶段，(2)扩增产物形成阶段。
(1)模板形成阶段由于仅采用随机单引物，因此可以有效扩增的模板必须是长度为5kb之内，且两端为引物对应序列的DNA分子。但是，通常在基因组DNA上并不存在合适的扩增区域。因此，在本发明的种质检测和鉴定方法中所涉及的PCR扩增条件中，必须包括以下模板形成阶段，即在较低温下退火，从而让变性的DNA分子有更多的机会通过折叠等方式在反应体系中形成供扩增的模板，否则将难以形成有效的扩增条带。
模板形成阶段通常包括至少在最初的5个(较佳地至少10个)循环，在这些循环中，退火温度为9±5℃下，退火时间为30-90sec。至于这些循环中的变性温度和延伸温度，可以采用常规PCR条件。
(2)扩增产物形成阶段产物扩增阶段指在形成了有效的供扩增模板后，大量形成产物的扩增阶段。该阶段的反应条件可以采用常规的PCR扩增条件。例如，扩增产物形成阶段包括25-40个循环，每个循环中，变性温度约为92℃，退火温度为引物的Tm左右，延伸温度约为72℃。
当然，两个阶段的扩增条件也可相同，以便简化操作程序。一种具体的扩增条件就是94±℃ 45±15sec，36±2℃ 45±15sec，72±2℃ 90±30sec，40～45个循环。
本发明的主要优点在于，本发明的种质检测方法简便，结果可靠。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例材料样本蟹分别采自辽河(辽宁盘锦)、黄河(山东东平)、长江(江苏镇江)、瓯江(浙江温州)、珠江(广东顺德)和南流江(广西合浦)的群体(以下简称辽河蟹、黄河蟹、长江蟹、瓯江蟹、珠江蟹、南流江蟹)，闽江水系绒螫蟹天然资源贫乏，未能采到样本。除黄河蟹为人工繁殖群体后代外，其他都是天然群体。对每群体随机取样，各30个体，雌雄各半。平均体重分别为98.2g(辽河)、107.2g(黄河)、139.8g(长江)、75.0g(瓯江)、50.1g(珠江)和38.1g(南流江)。
实施例1基因组DNA的提取剪取0.2g左右蟹腿肌肉，加入400uL STE缓冲液(30mmol/L Tris-HCl，pH8.0，200mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl)。混匀后加入终浓度分别为1％的SDS和200μg/mL的蛋白酶K，50℃作用5～8h。加入等体积饱和酚于转轮上缓慢转动1h，10,000r离心8min，吸取上清液加入等体积的混合液(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)，缓慢转动0.5h，弃下液层后，加入等体积的氯仿，缓慢转动5min，吸弃下液层后，加入等体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，再用70％的乙醇洗涤，干燥，加入500μL的TE溶解备用。
实施例2扩增反应条件的确定PCR反应混合物中含10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，50mmol/L KCl，2.0～3.0mmol/L MgCl2，0.001％的明胶，0.1mmol/L每种dNTP，引物浓度为0.2μmol/L，约125ng基因组DNA，1单位Taq酶，反应总体积为25μL，加入30μL石腊油。于PCR扩增仪上反应，循环程序为先94℃变性5min；接着94℃45sec，36℃45sec，72℃90sec，40～45个循环后，72℃延伸5min。取10微升扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后照像，分析。
实施例3扩增引物的筛选本实施例中，合成了共48个随机引物(Takara公司合成)，它们为经挑选的在绒螯蟹基因组中具有丰富多态性的10碱基引物。先用这48个引物对6群体各4个体(2雌2雄)共24个体进行扩增，对结果进行统计分析，在此基础上找出具有种群特征带的引物，然后进行大样本分析，每群体分析30个体，雌雄各半。
(a)扩增反应扩增反应条件同实施例2。
(b)基因组DNA的RAPD分析用48个多态引物对6群体各4个体(2雌2雄)共24只个体进行PCR扩增，扩增结果稳定，重复性好，具有丰富的引物特异性和模板特异性，未发现24个体中每种引物有2个谱带完全相同的情况。表明河蟹基因组具有丰富的遗传变异度。48个引物共扩增出288条带，平均每个引物扩增出6条带。扩增带大小分布在0.23-2.30kb之间。
结果(a)引物1，即TGACCCGCCT(SEQ ID NO1)扩增时，有一独特的947bp条带(图1)，该条带在6群体各4个体中的出现频率分别为长江蟹100％、南流江蟹75％、珠江蟹50％、瓯江蟹50％、黄河蟹25％、辽河蟹0％(图3)。
(b)用引物2，即CTTTCGCTCC(SEQ ID NO2)扩增时，有一880bp条带(图2)，该条带仅在珠江蟹和南流江蟹存在，而在长江蟹、辽河蟹、黄河蟹和瓯江蟹不存在。
另一扩增的700bp片段在长江蟹、辽河蟹、黄河蟹和瓯江蟹存在，而在珠江蟹和南流江蟹中不存在(图2)。
实施例4大样品(30个体)的种质检测和鉴定重复实施例3的方法。不同点在于，对每一群体河蟹用30个体替换原4个体，并且仅用引物1或仅用引物2进行PCR扩增。
结果(a)用引物1扩增时，947bp片段的出现频率分别为长江蟹87.50％、南流江蟹78.26％、瓯江蟹78.26％、珠江蟹61.66％、黄河蟹41.66％、辽河蟹10.83％(图4)；该片段在绒螫蟹种群内的出现频率在长江及长江以南水系中较高，而在黄河及黄河以北水系较低，表现出从长江到黄河到辽河显著降低的遗传渐变现象。
尤其是形态上难以区分的长江蟹和辽河蟹的该片段的出现频率相差极大，因此可作为有效区别两者的分子遗传标记物。
(b)大样本结果证实了，用引物2扩增出的700bp片段为长江蟹、辽河蟹、黄河蟹和瓯江蟹所特有，可作为区别日本绒螯蟹和中华绒螯蟹的分子遗传标记；此外，用引物2扩增出的880bp片段为珠江蟹和南流江蟹群体中所特有，可用于区分“珠江蟹、或南流江蟹”和“长江蟹、辽河蟹、瓯江蟹、黄河蟹”。
(c)对扩增数据进一步按常规方法计算群体内和群体间的遗传相似度，并计算遗传距离。
结果发现，6水系绒螫蟹群体内的遗传相似度大小依次为；辽河蟹0.908＞南流江蟹0.897＞瓯江蟹0.895＝珠江蟹0.895＞黄河蟹0.890＞长江蟹0.850。辽河蟹同其它水系绒螯蟹之间存在显著差异(P＜0.05)；长江蟹同其它水系绒螯蟹之间存在显著差异(P＜0.05)。
6水系绒螯蟹群体相互间的遗传相似度和遗传距离如下遗传相似度总平均值为0.778。南流江蟹与辽河蟹之间的遗传距离最大(0.203)，它们同其他水系蟹的遗传距离由北向南逐渐减小，表明绒螯蟹的基因组从南到北存在明显的歧化；在这一歧化中，南方(南流江蟹和珠江蟹)同北方(长江蟹、辽河蟹及黄河蟹)的遗传距离的平均值高达0.170，而北方3水系蟹的遗传距离平均值低达0.082(图5)。
实施例5试剂盒的制备和检测制备一河蟹种质检测和鉴定的试剂盒，它含有以下成分
*所述的说明书中注明，以提取的河蟹样品的DNA为模板，用引物1进行PCR扩增后，947bp条带的出现频率为80-100％就表明样品是长江蟹，而947bp条带的出现频率为0-20％就表明样品是辽河蟹。且用引物2扩增时，出现700bp条带表示样品是中华绒螯蟹，不出现700bp条带表示样品是日本绒螯蟹；出现880bp条带表示样品是珠江蟹或黄流江蟹，不出现880bp条带表示样品是长江蟹或辽河蟹。
用该试剂盒，对长江蟹和辽河蟹(各30个体)样品进行盲检测，发现一个样品中引物1的947bp条带出现频率为85％以上，且引物2扩增时有700bp条带，无880bp条带，判定为长江蟹。
一个样品中引物1的947bp条带出现频率为11％以下，且引物2扩增时有700bp条带，无880bp条带，判定为辽河蟹。
判定结果与实际情况相符。
讨论本发明人通过对绒螯蟹分子遗传标记的研究表明，辽河、黄河、长江和瓯江四个北方水系的蟹划为一组，把珠江和南流江两个南方水系的蟹划为另一组。这与以前基于形态学的分类是相一致的。
采用RAPD技术，利用引物1和2可方便地区分长江蟹和辽河蟹。尤其是引物2扩增的947bp片段的出现频率，在长江、黄河、辽河群体显著地从南到北递减，依次为长江蟹(87.50％)＞黄河蟹(41.66％)＞辽河蟹(10.83％)，这一遗传渐变的度量可作为区别这三个水系的中华绒螯蟹种群的判据。6水系群体内的平均遗传相似度依次为辽河蟹(0.908)＞南流江蟹＞(0.897)＞瓯江蟹(0.895)和珠江蟹(0.895)＞黄河蟹(0.890)＞长江蟹(0.850)；6群体间遗传距离等结果进一步表明，南方的南流江蟹、珠江蟹同北方的长江蟹、辽河蟹及黄河蟹在基因组之间存在明显的歧化。
除了用分子遗传标记物进行区分外，还可结合目前现有的以下一些鉴定方法进一步检验检测结果(1)形态学鉴定1.1例如，测量30只以上的大样本，每只蟹测量32个外部形态特征，并通过聚类分析、判别分析予以比较分析。长江蟹的第3步足长节较长，对体长的比值为0.793±0.040；而辽河蟹的第3步足掌节较长，对体长的比值为0.530±0.030。
1.2幼蟹来源判别公式例如测量30个形态特征值，利用聚类分析和逐步判别两种多元分析方法予以聚类分析，长江和瓯江蟹种形态相近，而辽河蟹种与它们差异较大。从上述30个可量性状中筛选出9个贡献较大的参数，建立简易判别公式，对长江、瓯江及辽河3种群蟹的平均拟合概率为80.4％。
1.3成蟹来源判别公式测量24个形态特征值，用逐步判别的方法，筛选出其中贡献较大的6个参数，建立判别函数，对雄蟹的判别拟合概率为92.39％，雌蟹为89.37％。
1.4性早熟判别公式结合生殖腺的组织学研究，对发生性早熟与未发生性早熟的中华绒螯蟹幼蟹的22个形态特征参数进行了比较，确定了判别雌、雄中华绒螯蟹性早熟的三个形态特征参数，建立了性早熟早期的判别公式，对雌蟹的判别准确率达90.9％以上，对雄蟹的判别准确率达96.9％以上。
(2)生化遗传学鉴定采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析可比较分布于我国大陆沿海6个主要水系的两种绒螯蟹(中华绒螯蟹、日本绒螯蟹)群体间的生化遗传差异。辽河、黄河、长江、瓯江中华绒螯蟹与珠江、南流江日本绒螯蟹在SOD同工酶表型上有明显差异，SOD-2位点仅在辽河、黄河、长江、瓯江中华绒螯蟹中表达，而SOD-4位点仅在珠江、南流江日本绒螯蟹中表达，这一差别可作为区分中华绒螯蟹与日本绒螯蟹群体的生化遗传标志。
中华绒螯蟹—日本绒螯蟹种质差异要点，以及中华绒螯蟹长江种群——辽河种群种质差异要点总结于下表
表1 中华绒螯蟹与日本绒螯蟹种质差异要点，以及中华绒螯蟹长江种群与辽河种群种质差异要点
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>李，思发<120>中华绒螯蟹种质检测和鉴定技术<130>027697<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(10)<223>引物<400>1tgacccgcct 10<210>2<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(10)<223>引物<400>2ctttcgctcc 10
权利要求
1.一种河蟹种质检测和鉴定的方法，其特征在于，包括步骤(a)提取河蟹样品的DNA；(b)以步骤(a)的DNA为模板，用引物TGACCCGCCT(SEQ ID NO1)进行PCR扩增，并对扩增产物进行分析，其中，947bp条带的出现频率为80-100％就表明样品是长江蟹，而947bp条带的出现频率为0-20％就表明样品是辽河蟹。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)的PCR的扩增条件包括在DNA变性后，进行35-50个扩增循环，所述的扩增循环中退火温度为39±5℃。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(b)的PCR的扩增条件包括在94±2℃变性3-20min，1个循环；94±2℃ 45±15sec，36±2℃ 45±15sec，72±2℃ 90±30sec，40～45个循环；72±2℃延伸3-20min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，947bp条带的出现频率为80-100％就表明样品是长江蟹，而947bp条带的出现频率为0-20就表明样品是辽河蟹。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中的分析是电泳分析，且河蟹样品的数量为4-100只。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括步骤(b′)以步骤(a)的DNA为模板，用引物CTTTCGCTCC(SEQ ID NO2)进行PCR扩增，并对扩增产物进行分析，其中，出现700bp条带表示样品是中华绒螯蟹，不出现700bp条带表示样品是日本绒螯蟹；出现880bp条带表示样品是日本绒螯蟹，不出现880bp条带表示样品是中华绒螯蟹。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括步骤对河蟹样品进行形态判别分析和生化遗传差异分析。
8.一种用于河蟹种质检测和鉴定的试剂盒，其特征在于，它包含(a)引物TGACCCGCCT(SEQ ID NO1)；(b)说明书，所述的说明书中注明，以提取的河蟹样品的DNA为模板，用引物TGACCCGCCT(SEQ ID NO1)进行PCR扩增后，947bp条带的出现频率为80-100％就表明样品是长江蟹，而947bp条带的出现频率为0-20％就表明样品是辽河蟹。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包含(c)提取DNA所需的试剂；(d)PCR反应所需的试剂。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包含(e)引物CTTTCGCTCC(SEQ ID NO2)。
全文摘要
本发明公开了一种利用分子遗传标记物等进行中华绒螯(河蟹)蟹种质检测和鉴定的方法，包括步骤(a)提取河蟹样品的DNA；(b)以步骤(a)的DNA为模板，用引物TGACCCGCCT(SEQ ID NO1)进行PCR扩增，并对扩增产物进行分析，其中，947bp条带的出现频率为80－100％就表明样品是长江蟹，而947bp条带的出现频率为0－20％就表明样品是辽河蟹。该方法可快速有效地区分长江蟹和辽河蟹。本发明还提供了相应的检测试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK1511960SQ02160498
公开日2004年7月14日 申请日期2002年12月27日 优先权日2002年12月27日
发明者李思发, 邹曙明, 赵金良, 王成辉, 蔡完其 申请人:李思发