一种检测中华绒螯蟹胚胎冷冻后细胞骨架结构损伤的方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测中华绒螯蟹胚胎冷冻后细胞骨架结构损伤的方法，包括：(1)分别选取新鲜胚胎和经过超低温冷冻的胚胎，用B-PBS漂洗，固定，漂洗；(2)将冷冻前后胚胎的胚盘从卵中剥离；采用Triton-100在室温下与胚胎作用，漂洗，室温下封闭，用actin抗体在室温下与胚胎作用，漂洗，再用标有异硫氰荧光素的羊抗兔IgG在室温下与胚胎作用，漂洗，将胚胎吸出滴在载玻片上，载玻片上加防荧光淬灭剂，再用甘油与PBS混合液封片，观察冷冻前后胚胎样品荧光着色情况。本发明能准确检测中华绒螯蟹胚胎细胞骨架结构损伤，对损伤程度进行量化，结果更直观，更可靠，检测准确率达到99％以上。
【专利说明】
一种检测中华绒螯蟹胚胎冷冻后细胞骨架结构损伤的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于水产养殖种质保存领域，涉及到一种检测中华绒螯蟹胚胎冷冻后细胞骨架结构损伤的方法。
【背景技术】
[0002]我国是一个水生生物种质资源较为丰富的国家，丰富多样的水生生物种质资源和遗传多样性对于我国水产养殖业的快速发展起到了非常重要的作用。随着社会经济的发展，水生生物生存环境的严重恶化，过度捕捞、有害渔具渔法的运用以及水利工程建设等诸多原因，导致渔业生物资源衰退，传统渔获产量下降，大量水生生物处于灭绝或濒危状态。利用低温生物学的原理，建立优良养殖鱼类或濒临灭绝鱼类的冷冻配子库和胚胎库，可以实现对优良鱼类原良种的长期保存，避免过度捕捞、生态破坏或环境污染造成的鱼类物种灭绝或因近亲交配而形成的种质退化和遗传变异现象。
[0003]低温技术是一把双刃剑，应用得当时，低温可以长期保存生命；应用不得当，低温又会产生严重损伤、杀死生物。近50年来，超低温冷冻保存技术被广泛应用于人类和很多哺乳动物的生殖繁育上，尽管超低温冷冻保存已经获得了很大的成功，但这种冷冻保存技术仍然会对细胞造成致死和亚致死损伤。甲壳动物一中华绒螯蟹胚胎已冷冻保存成功，但胚胎解冻后成活率不高，结果难以重复，超低温冷冻对其胚胎损伤机理不祥。细胞骨架是细胞的一种超微结构，是遍布于整个细胞的一种复杂的蛋白质纤维网络，起支持、转运、运动的作用，在胚胎发育中具有十分重要的作用，因此细胞骨架结构的完整性是评判胚胎冷冻损伤的重要依据。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种检测中华绒螯蟹胚胎冷冻后细胞骨架结构损伤的方法，该方法能准确检测中华绒螯蟹胚胎细胞骨架结构损伤，对损伤程度进行量化，结果更直观，更可靠，检测准确率达到99%以上。
[0005]本发明的一种检测中华绒螯蟹胚胎冷冻后细胞骨架结构损伤的方法，包括:
[0006](I)分别选取中华绒螯蟹新鲜胚胎和经过超低温冷冻的胚胎，用B-PBS漂洗，漂洗后将2组胚胎样品分别放入多聚甲醛中固定，再用B-PBS漂洗；
[0007](2)将冷冻前后胚胎的胚盘从卵中剥离；采用Triton-100在室温下与胚胎作用10?20min，B-PBS漂洗，再用PBS液室温下封闭I?2小时，用actin抗体在室温下与胚胎作用70?80min，B-PBS漂洗，再用标有异硫氰荧光素的羊抗兔IgG在室温下与胚胎作用35?40min，PBS漂洗，将胚胎吸出滴在载玻片上，载玻片上加防荧光淬灭剂，再用甘油与PBS混合液封片，激光共聚焦显微镜下观察冷冻前后胚胎样品荧光着色情况。
[0008]所述步骤(I)和⑵中的B-PBS为含0.3%牛血清蛋白的PBS ;漂洗3次，每次1min0
[0009]所述步骤(I)中的多聚甲醛浓度为4%。
[0010]所述步骤(2)中的Triton-100的浓度为0.1%。
[0011]所述步骤⑵中的PBS液含I %牛血清蛋白和0.05% Tween20。
[0012]所述步骤(2)中actin抗体按1:80稀释。
[0013]所述步骤(2)中异硫氰荧光素的羊抗兔IgG按1:60稀释。
[0014]所述步骤(2)中的防荧光淬灭剂为DABC0。
[0015]所述步骤⑵中的甘油与PBS混合液中甘油与PBS的体积比为9:1。
[0016]本发明通过对中华绒螯蟹冷冻前后胚胎采用改进后的方法进行荧光染色，激光共聚焦显微镜观察冷冻前后胚胎荧光信号强度和荧光量，分析冷冻前后胚胎细胞骨架结构的变化，建立检测胚胎冷冻后细胞骨架结构损伤的方法。
_7] 有益.效果
[0018]本发明能准确检测中华绒螯蟹胚胎细胞骨架结构损伤，对损伤程度进行量化，结果更直观，更可靠，检测准确率达到99%以上。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0020]实施例1
[0021]在中华绒螯蟹繁殖季节，采集中华绒螯蟹胚胎，部分胚胎采用30% 1，2丙二醇+20%二甲基甲酰胺作为抗冻保护液，胚胎在抗冻液中按照分步平衡法平衡40min，在-196°C冷冻40min，快速解冻后用0.25mol/L的蔗糖洗脱lOmin，获得了冻后胚胎样品。分别选取冷冻前后胚胎各30粒，用含0.3%牛血清蛋白的PBS(B-PBS)漂洗3次，每次lOmin，漂洗后将这2组胚胎样品分别放入4%的多聚甲醛中于4°C培养箱中固定3小时，再用0.3% B-PBS漂洗3次，每次lOmin。用解剖针将冷冻前后胚胎的胚盘从卵中剥离，0.1%的Triton-1OO在室温下与胚胎作用1min进行打孔处理，处理完成后用0.3% B-PBS漂洗3次，每次1min0用含I %牛血清蛋白(BSA)和0.05% Tween20 ( —种表面活性剂)的PBS液室温下封闭胚胎I小时，用兔抗鼠的抗体actin抗体(按1:80稀释)在室温下与胚胎作用70min，稀释液为含5%山羊血清和5%二甲亚砜的Tris盐酸缓冲液，0.3% B-PBS漂洗3次，每次lOmin，再用标有异硫氰荧光素的羊抗兔IgG(IgG-FITC)(按1:60稀释)在室温下与胚胎作用35min，0.3% B-PBS漂洗3次，每次lOmin。在洁净的载玻片上加一滴防荧光淬灭剂DABCO，将处理后的胚胎转入其中，再用甘油与PBS(体积比9:1)的混合液封片。
[0022]OLYMPUS FV-1OOO激光共聚焦显微镜观察冷冻前后胚胎样品荧光着色情况。与鲜胚相比，冻胚细胞的荧光信号减弱，就冻胚而言，荧光信号越强表明冷冻对胚胎细胞骨架结构影响越小，若荧光信号消失则表明冻胚细胞死亡；通过荧光定量分析冷冻前后胚胎荧光强度，冷冻后胚胎荧光强度越大表明胚胎细胞骨架结构越完整，受冷冻损伤越小；荧光强度越小则表明胚胎细胞骨架结构受冷冻影响越大。
[0023]运用这种方法能准确检测中华绒螯蟹胚胎细胞骨架结构损伤，对损伤程度进行量化，结果更直观，更可靠，检测准确率达到99%以上。
【权利要求】
1.一种检测中华绒螯蟹胚胎冷冻后细胞骨架结构损伤的方法，包括: (1)分别选取中华绒螯蟹新鲜胚胎和经过超低温冷冻的胚胎，用B-PBS漂洗，漂洗后将2组胚胎样品分别放入多聚甲醛中固定，再用B-PBS漂洗； (2)将冷冻前后胚胎的胚盘从卵中剥离；采用Triton-1OO在室温下与胚胎作用10?20min, B-PBS漂洗，再用PBS液室温下封闭I?2小时，用act in抗体在室温下与胚胎作用70?80min，B-PBS漂洗，再用标有异硫氰荧光素的羊抗兔IgG在室温下与胚胎作用35?40min, PBS漂洗，将胚胎吸出滴在载玻片上，载玻片上加防荧光淬灭剂，再用甘油与PBS混合液封片，激光共聚焦显微镜下观察冷冻前后胚胎样品荧光着色情况。
2.根据权利要求1所述的一种检测中华绒螯蟹胚胎冷冻后细胞骨架结构损伤的方法，其特征在于:所述步骤(I)和(2)中的B-PBS为含0.3%牛血清蛋白的PBS ;漂洗3次，每次1min0
3.根据权利要求1所述的一种检测中华绒螯蟹胚胎冷冻后细胞骨架结构损伤的方法，其特征在于:所述步骤(I)中的多聚甲醛浓度为4%。
4.根据权利要求1所述的一种检测中华绒螯蟹胚胎冷冻后细胞骨架结构损伤的方法，其特征在于:所述步骤(2)中的Triton-100的浓度为0.1%。
5.根据权利要求1所述的一种检测中华绒螯蟹胚胎冷冻后细胞骨架结构损伤的方法，其特征在于:所述步骤(2)中的PBS液含1%牛血清蛋白和0.05% Tween20。
6.根据权利要求1所述的一种检测中华绒螯蟹胚胎冷冻后细胞骨架结构损伤的方法，其特征在于:所述步骤(2)中actin抗体按1:80稀释。
7.根据权利要求1所述的一种检测中华绒螯蟹胚胎冷冻后细胞骨架结构损伤的方法，其特征在于:所述步骤(2)中异硫氰荧光素的羊抗兔IgG按1:60稀释。
8.根据权利要求1所述的一种检测中华绒螯蟹胚胎冷冻后细胞骨架结构损伤的方法，其特征在于:所述步骤(2)中的防荧光淬灭剂为DABC0。
9.根据权利要求1所述的一种检测中华绒螯蟹胚胎冷冻后细胞骨架结构损伤的方法，其特征在于:所述步骤(2)中的甘油与PBS混合液中甘油与PBS的体积比为9:1。
【文档编号】G01N21/64GK104390944SQ201410598177
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】黄晓荣, 庄平, 章龙珍, 冯广朋, 赵峰, 刘鉴毅, 张涛, 宋超, 王妤 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所