一种用无水氯化钙诱导中华绒螯蟹三倍体的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及水产养殖技术领域，具体涉及一种中华绒螯蟹三倍体诱导方法。
【背景技术】
[0002]中华绒螯蟹(俗称河蟹、大闸蟹)养殖业是我国水产行业的支柱性产业之一，但目前其发展遭遇了商品蟹小型化及性早熟等问题的严重困扰。作为品质改良的重要途径之一，多倍体培育已在多种鱼类、贝类中成功开展，某些种类已经达到商业化生产规模。基于三倍体动物在生长发育方面的优势以及特殊的性腺发育特点，三倍体蟹的苗种培育有望解决目前河蟹性早熟、生长慢、商品蟹规格偏小等难题，从而培育大规格的河蟹，提高养殖产量和效益。
[0003]现有的蟹类多倍体诱导方法限制较多。如中国发明专利“一种中华绒螯蟹三倍体的诱导方法”(授权号CN 1141018C)公开了一种利用细胞松弛素B、热休克及6-DMAP (6 —二甲基氨基嘌呤)诱导河蟹多倍体的方法。
[0004]中国发明专利“一种中华绒螯蟹三倍体诱导新方法”(申请号201310235286.7)公开了利用氯化钾(KCl)诱导河蟹多倍体的新方法及其改进措施，明显提高了中华绒螯蟹三倍体诱导的稳定性和有效性。
[0005]但是，细胞松弛素B和6-DMAP对人体、水生生物及环境都具有明显的生物学毒性，且价格较贵，不适于生产性推广；热休克方法对亲蟹的存活影响明显；KC1价格低廉且对人体、水生生物低毒，也提高了中华绒螯蟹三倍体诱导的稳定性和有效性，但是其诱导有效浓度及生物耐受浓度间的矛盾限制了其诱导稳定性；所以筛选更加稳定高效的诱导试剂、试验新的三倍体诱导方法已十分必要。
【发明内容】
[0006]本发明公开了一种新型中华绒螯蟹三倍体诱导方法，在该方法中应用绿色环保且价格低廉的无水氯化钙为多倍体诱导试剂，在克服传统的多倍体诱导试剂存在的不足与限制的同时，能够明显提高中华绒螯蟹三倍体诱导稳定性和有效性。
[0007]为实现上述目的，本发明提供的技术方案是，一种中华绒螯蟹三倍体诱导方法，所述方法具体步骤如下:
(1)中华绒螯蟹受精卵的获得:已确认交配过的雌蟹单只置于产卵箱内待产，15°C下亲蟹产卵1.5h左右剪取部分受精卵用于药物处理实验；
(2)无水氯化钙的多倍体诱导有效性鉴定及诱导参数优化:设定氯化钙浓度梯度，将受精膜举起作为诱导起始时刻的形态学标记，以氯化钾处理的受精卵作为阳性对照，以不做处理的受精卵作为阴性对照，根据流式细胞仪的检测结果验证无水氯化钙的三倍体诱导有效性并对其诱导浓度进行优化；
(3)中华绒螯蟹三倍体苗种的批量诱导:抱卵亲蟹标记后，利用优化的诱导参数进行整蟹的批量处理，待受精卵发育到囊胚期以后抽取部分胚胎样品用流式细胞仪的检测，以此估算整体诱导率。
[0008]其中，本发明所述的新型多倍体诱导剂中文名为无水氯化钙，分子式CaCl2，分子量110.99，纯度为分析纯，已潮解或部分潮解的无水氯化钙应避免使用。
[0009]其中，所述步骤(I)受精卵的获得是将已确认交配过的雌蟹单只置于产卵箱内待产，记录准确的产卵时间，15°C下产卵后1.5h的正常发育受精卵在显微镜下应为葡萄串状粘附在亲蟹附肢刚毛上，卵膜完整，受精膜已开始举起。
[0010]其中，所述步骤(2)基于形态学标记的药物诱导起始时刻的确定是将受精膜举起作为诱导起始时刻的形态学标记，当观察到80%以上受精卵开始举起受精膜时将受精卵样品转移到三倍体诱导药物中，开始中华绒螯蟹三倍体的诱导处理。
[0011]其中，所述步骤(2)和(3)流式细胞仪检测是对待测样品的DNA相对含量进行分析，以确定待测样品的染色体倍性。
[0012]其中，所述步骤(2) CaCl2诱导最优参数的确定及应用是通过对比实验确定CaCl2诱导中华绒螯蟹三倍体的有效浓度及处理持续时间并加以应用。
[0013]其中，CaCl2诱导的适宜浓度为2%，处理持续时间为4h，处理温度为15?16°C，CaCl2处理液用18%。的咸淡水配制。
[0014]其中，所述步骤(3)亲蟹的标记方法是将连续编码的塑料标签两端打孔，用细扎带绑缚在雌蟹第3或4步足长节上。
[0015]本发明的有益效果是:
1、无水氯化钙对人体、水生生物及环境无毒害作用，是绿色环保的新型多倍体诱导剂，且价格低廉便于推广；
2、亲蟹对氯化钙的耐受力强，较好地解决了三倍体诱导过程中药物有效浓度与亲蟹对诱导药物耐受力之间的矛盾；
3、氯化钙对生物刺激性小，三倍体诱导效率高且稳定性强，是具有抱卵习性的虾蟹类多倍体苗种生产的适宜诱导剂。
[0016]本发明运用无水氯化钙为一种绿色环保的新型多倍体诱导剂，既克服了化学试剂细胞松弛素B和6-DMAP有明显的生物学毒性、价格较贵、不适于生产性推广的缺陷，又进一步提高，解决了类似于KCl诱导三倍体过程中存在的有效浓度及生物耐受浓度间的矛盾尴尬，同时能够明显提高中华绒螯蟹三倍体诱导的稳定性和有效性，为中华绒螯蟹三倍体苗种规模化培育提供了技术支持。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
[0018]实施例1，用无水氯化钙批量诱导中华绒螯蟹三倍体本实施例按照以下步骤进行:
(O亲蟹暂养:选择附肢齐全、活力旺盛、性腺发育良好的雌、雄蟹各150只，雌雄分开放养于2个盛有淡水且底部铺沙的水泥池(10.5X3.5X1.2m)中暂养7d，每天投喂新鲜蛤肉，视水质情况适当换水； (2)分批驯化:每次挑选雌、雄蟹各50只，雌雄分开放养于2个底部铺沙的室内水泥池(3.5X1.5X1.2m)中，在I天时间内分4次将盐度从O升高到18%。，并保持此盐度3?4天，每天投喂新鲜蛤肉，视水质情况适当换水；
(3)亲蟹标记及交配:亲蟹驯化第5d时，将雌雄蟹捞出，在雌蟹第3或4步足基部长节上用细扎带绑缚带数字编码的塑料标签，放入实用新型发明“一种稳定提高中华绒螯蟹多倍体诱导效率的便利设施”(申请号201320014475.7)中并启动该设施，每个交配产卵小室放雌雄蟹各I只，待自然交配完成、雌雄蟹分开后及时移走雄蟹，留下雌蟹待产；
(4)亲蟹产卵及三倍体诱导:在发现某只亲蟹产卵后回放视频录像以确定大概的产卵时间，15°C下产卵1.5h左右剪取少量受精卵在显微镜下进行形态学观察，一旦发现超过80%以上卵的受精膜开始举起则开始三倍体的诱导，用晾衣夹(竹夹子)撑开抱卵蟹腹甲并移到2%的CaCl2诱导液(用18%。海水配制)中，用手撑开抱卵蟹腹甲中并轻轻摆动，以后每隔10-20min撑开抱卵蟹腹甲并轻轻摆动一次，以增加CaCl2与受精卵的接触面积以及CaCl2对受精卵的渗透，15°C?16°C下处理4h后取出，再次用手撑开抱卵蟹腹甲中并在不含诱导液的育苗水(盐度18%。)中轻轻摆动以尽快解除CaCl2的作用；
(5)胚胎三倍体率检测:待胚胎发育到囊胚期，剪取少量胚胎带回实验室用流式细胞仪检测胚胎的倍性组成，三倍体率最高为85.33%，最低为10.38%，总体诱导率为61.24%。
[0019](6)受精卵孵化:选取诱导率最高的抱卵蟹进行单独孵化，I期潘状幼体的三倍体率为 82.72%。
[0020]本发明采用无水氯化钙作为多倍体诱导试剂，在成功克服其他诱导药物不足与缺点的同时，其对中华绒螯蟹三倍体诱导的稳定性和有效性也有明显提高，为中华绒螯蟹三倍体苗种规模化培育提供了技术支持。
[0021]以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
【主权项】
1.一种用无水氯化钙诱导中华绒螯蟹三倍体的方法，其特征在于，所述方法具体步骤如下: (1)中华绒螯蟹受精卵的获得:已确认交配过的雌蟹单只置于产卵箱内待产，15°c下亲蟹产卵1.5h左右剪取部分受精卵用于药物处理实验； (2)无水氯化钙的多倍体诱导有效性鉴定及诱导参数优化:设定氯化钙浓度梯度，将受精膜举起作为诱导起始时刻的形态学标记，以氯化钾处理的受精卵作为阳性对照，以不做处理的受精卵作为阴性对照，根据流式细胞仪的检测结果验证无水氯化钙的三倍体诱导有效性并对其诱导浓度进行优化； (3)中华绒螯蟹三倍体苗种的批量诱导:抱卵亲蟹标记后，利用优化的诱导参数进行整蟹的批量处理，待受精卵发育到囊胚期以后抽取部分胚胎样品用流式细胞仪的检测，以此估算整体诱导率。
2.如权利要求1所述的用无水氯化钙诱导中华绒螯蟹三倍体的方法，其特征在于，所述步骤(I)受精卵的获得是将已确认交配过的雌蟹单只置于产卵箱内待产，记录准确的产卵时间，15°C下产卵后1.5h的正常发育受精卵在显微镜下应为葡萄串状粘附在亲蟹附肢刚毛上，卵膜完整，受精膜举起。
3.如权利要求1所述的用无水氯化钙诱导中华绒螯蟹三倍体的方法，其特征在于，所述步骤(2)基于形态学标记的药物诱导起始时刻的确定是将受精膜举起作为诱导起始时刻的形态学标记，当观察到80%以上受精卵开始举起受精膜时将受精卵样品转移到三倍体诱导药物中，开始中华绒螯蟹三倍体的诱导处理。
4.如权利要求1所述的用无水氯化钙诱导中华绒螯蟹三倍体的方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)流式细胞仪检测是对待测样品的DNA相对含量进行分析，以确定待测样品的染色体倍性。
5.如权利要求1所述的用无水氯化钙诱导中华绒螯蟹三倍体的方法，其特征在于，所述步骤(2)无水氯化钙诱导最优参数的确定及应用是通过对比实验确定无水氯化钙诱导中华绒螯蟹三倍体的有效浓度及处理持续时间并加以应用。
6.如权利要求1或5所述的用无水氯化钙诱导中华绒螯蟹三倍体的方法，其特征在于，所述氯化钙诱导的适宜浓度为2%，处理持续时间为4h，处理温度为15?16°C，氯化钙处理液用18%。的咸淡水配制。
7.如权利要求1所述的用无水氯化钙诱导中华绒螯蟹三倍体的方法，其特征在于，所述步骤(3)亲蟹的标记方法是将连续编码的塑料标签两端打孔，用细扎带绑缚在雌蟹第3或4步足长节上。
【专利摘要】本发明公开了一种用无水氯化钙诱导中华绒螯蟹三倍体的方法，首先利用自然交配的亲蟹获得正常发育的受精卵；然后根据对比试验确定了无水氯化钙的三倍体诱导有效性并对其诱导参数进行了优化处理；最后根据优化参数进行了中华绒螯蟹三倍体的批量诱导。本发明用无水氯化钙作为诱导试剂，绿色环保，对生物、人体及环境无毒害作用；本方法明显提高了中华绒螯蟹三倍体诱导的稳定性和有效性，为中华绒螯蟹三倍体苗种规模化培育提供了技术支持。
【IPC分类】C12N15-01, A01K61-00
【公开号】CN104621009
【申请号】CN201310543245
【发明人】张成松, 相建海, 李富花
【申请人】南通中国科学院海洋研究所海洋科学与技术研究发展中心, 中国科学院海洋研究所
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2013年11月6日