专利名称：中华绒螯蟹Crustin-2基因及其重组蛋白的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，涉及中华绒螯蟹Crustin-2基因序列，具体地说是从中华绒螯蟹cDNA文库中筛选出中华绒螯蟹Crustin-2相关的EST序列，并拼接成全序列，然后进行了 Crustin-2的原核重组表达并进行了相应抗菌活性的鉴定。该发明涉及到Crustin-2基因及其表达产物在药物生产、饲料添加剂以及防腐剂和保鲜剂生产中的应用。
背景技术：
抗菌肽是广泛存在于生物界中的双亲性小分子碱性多肽，是机体固有免疫的关键因子。Steiner最早在天蚕中发现后，到目前为止，在各种生物中总共发现了 800多种抗菌肽。根据抗菌肽的序列、二级结构和抗菌特性等，将己发现的抗菌肽分为四大类(1)不含半胱氨酸的线型抗菌肽，如天蚕素、马盖宁等；(2)具有半胱氨酸的环型抗菌肽，如防御素，抗真菌肽等；(3)富含某一种或两种氨基酸的抗菌肽，主要包括富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗菌肽等；(4)由前体大分子酶解产生的抗菌肽，如鲎的血蓝蛋白。Crustin作为一种针对革兰氏阳性菌的抗菌肽，首先是在岸蟹中发现的(Rdfetal.,1999)。随后的研究发现其氨基酸序列在在其C末端有12个Cys，其中8个位置保守，形成WAP结构域。
中华绒螯蟹(五n'oc/^VWw似/力又名河蟹，因其营养丰富、味道鲜美而深受人们喜爱，fe我国重要的水产养殖品种之一。自20世纪80年代以来，中华绒螯蟹养殖业发展迅速，到2000年全国养殖产量已超过100 OOOt,年产值达120-150亿元，已成为水产养殖支柱产业之一(崔朝霞等，2003)。但随着中华绒螯蟹养殖规模的不断扩大，各种疾病日趋严重，给养殖产业造成了巨大损失。养殖中华绒螯蟹病害的不断爆发及病因的多样性迫切要求从机体自身的免疫防御因子入手研究其抗病机制和制定新的疾病防治措施。Crustin作为一种重要的针对革兰氏阳性菌的抗菌肽在其免疫防御中发挥着非常重要的作用。
发明内容
本发明的目的是从中华绒螯蟹中克隆Cmstin-2，并对其进行原核重组表达及重组产物的活性鉴定，为进一步研究中华绒螯蟹疾病防御机制提供基础，并为中华绒螯蟹的病害防治、基因辅助选育及进一步开发为医药产品和词料添加剂奠定基础。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
利用构建的cDNA文库，采用RACE技术以及体外重组表达等技术，对中华绒螯蟹Crustin-2进行了研究，首次从中华绒螯蟹中克隆到Crustin-2，该基因具有序列表中所示的序
3列。
本发明从中华绒螯蟹中克隆到Crustin-2基因cDNA全长1255bp，包含一个339 bp的开放阅读框，编码112个氨基酸，5'非编码区长30bp， 3'非编码区长886bp，有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴，该基因在中华绒螯蟹免疫防御方面发挥着重要作用。它具有SEQID NO. 1所示的序列。
其编码的蛋白具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，分子量为12369.06,等电点为6.76 ，其中编码序列的l-19为信号肽序列，成熟肽分子量为10464.64，等电点为6.21。具有典型的WAP结构域。利用pET30a(+)表达载体在大肠杆菌origami (DE3)重组表达了该蛋白，表达产物对革兰氏阳性菌具有明显抑菌活性，如藤黄微球菌(M&racoca^ 枯草杆菌(5a"7/wj jwMfo)、 四联球菌(M/crococcm /"mge"ws)禾口苏云金芽孢杆菌(6a"7/tts Awn'"g/e柳'j)的最小抑菌浓度分别为0.093 pM、 0.19 nM、 0.37 pM和0.093 而对革兰氏阴性菌，如大肠杆菌&c^eHcWa co"和鳗弧菌ij'sfo"e〖a 。"gw!7/an/m没有杀伤活力。中华绒螯蟹Crustin-2基因的重组表达产物可作为动物饲料添加剂、食品防腐剂、食品保鲜剂。
本发明利用表达序列标签(EST)技术、cDNA末端快速扩增(RACE)技术从中华绒螯蟹中克隆到Crustin-2基因cDNA全长序列，通过PCR技术，扩增编码Crustin-2成熟肽的基因片段并将其克隆到pET30a(+)表达载体中，在大肠杆菌Origami (DE3)实现体外重组表达。重组产物经HiTrap chelating柱纯化和透析后，对藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、四联微球菌和苏云金芽孢杆菌都具有较强的杀菌活力，最小抑菌浓度分别为0.093 ^M、 0.19 nM、 0.37和0.093 ^M;对革兰氏阴性菌没有明显的杀菌活力。本发明可以为进一步研究中华绒螯蟹免疫防御机制提供基础，并为中华绒螯蟹的病害防治、基因辅助选育和饲料添加剂奠定基础，同时为进一步开发为医药产品奠定基础。实施实例1:
本发明中的中华绒螯蟹Crustin-2的cDNA序列克隆及体外重组表达包括下列步骤
a) 中华绒螯蟹总RNA的提取及mRNA的纯化；
b) 中华绒螯蟹cDNA文库构建；
c) 中华绒螯蟹cDNA文库EST序列的大规模测定；
d) 中华绒螯蟹EST序列的同源性分析及Crustin-2基因片段的筛选；
e) EST序列拼接获得Cmstin-2的全序列；
f) 中华绒螯蟹Crustin-2的体外重组表达及活性分析。具体操作如下
.中华绒螯蟹总RNA的提取及mRNA的纯化利用Invitrogen公司的Trizol试剂从感染了鳗弧菌的中华绒螯蟹血淋巴中提取总RNA，利用QIAGENE公司的OligotexmRNA纯化试剂盒纯化mRNA。
2. 中华绒螯蟹cDNA文库构建利用Stratagene公司cDNA Synthesis Kit和ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene)进行cDNA的合成，双链cDNA经末端补平、五co及I接头连接、￡co/ I末端磷酸化、A7zo I内切酶酶切后利用QIAGEN公司QIAEX II AgaroseGel Extraction Kit对大于lOObp的酶切片段进行回收，与Invitrogen公司Uni-ZAP XRvector载体连接，利用Stratagene公司的ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit试剂盒进行文库包装，利用Exassist Helper Phage和SOLR菌株从Uni-ZAP XRVector上体外切割pBluescript成为质粒文库。
3. 中华绒螯蟹cDNA文库EST序列的大规模测定文库中筛选阳性克隆，使用载体通用引物T3在MegaBACE1000测序仪上进行序列测定，将得到的原始峰图文件(*.abi，*.abd文件)数据经Phred程序处理转化为序列文件(*.seq)和质量文件(气s叫.qual)，依据质量文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用cross-mach程序屏蔽数据中的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于Q13 (准确率大于95%)且长度大于100bp的序列作为EST数据，具体《基因表达序列标签(EST)数据分析手册》(胡松年著，浙江大学出版社，2005年)。
4. 中华绒螯蟹EST序列的同源性分析及Crustin-2基因片段的筛选将获得的全部有效的EST数据进行聚类拼接，生成Contigs禾Q Singletons,分别将所获的Contigs与Singletons在数据库中进行BLASTn和BLASTx分析，根据相似性分析结果寻找出与Crustin-2基因同源的EST序列。
5. 中华绒螯蟹Crustin-2基因cDNA全长序列的克隆根据Crustin-2的EST序列设计特异 性 引 物 Fl (GTGCGACAGGAACCAGAAGC) 禾卩 Rl(CTCGGGCTTCTGGTTCCTGT)， 分别利用载体通用引物 T3(AATTAACCCTCACTAAAGGG)禾卩T7 (GTAATACGACTCACTATAGGGC)进行3，和5'末端的扩增。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收试剂盒(上海博大泰克)进行PCR产物的回收和纯化，再与pMD-18T载体(大连宝生物工程有限公司)连接，然后转化大肠杆菌感受态细胞T叩10F',挑选阳性克隆用载体引物M13-47和RV-M进行测序，所得结果经CLUSTER分析拼接和得到全长序列。
3'RACE扩增所用反应体系及反应条件25 [d反应体系，包含2.5 nl 10xPCR buffer,1.5^1 MgCl2 (2.5 mM),
1.0 nl弓I物F1 (lOpmo,)，
1.0 ^引物T7(10pmol/pl)，
2.0 nl dNTP (2.5 mM)，
0.15 |il Taq DNA polymerase (Promega),
l.OplcDNA模板，
15.85PCR-grade water。
反应在PTC-100PCR热循环仪(MJ Research)中进行，反应条件为94。C预变性5分钟，然后进入35个循环94。C变性30秒'59'C退火30秒'72"C延伸60秒。最后进行72°C延伸IO分钟。
5'RACE扩增所用反应体系及反应条件
25 反应体系
2.5 pl 10xPCR buffer,
1.5^1 MgCl2 (2.5mM),
1.0 nl引物R1 (10pmoLVl)，
1.0 pi引物T3(10pmo骑
2.0 nl dNTP (2.5 mM)，
0.15 pi Taq DNA polymerase (Promega),
1.0 jilcDNA模板，
15.85 nl PCR隱grade water。
反应在PTC-100PCR热循环仪(MJ Research)中进行，反应条件为94。C预变性5分钟，然后进入35个循环94。C变性30秒'60。C退火30秒'72。C延伸90秒。最后进行72°C延伸IO分钟。阳性克隆的PCR筛选条件为.-
25 nl反应体系
2.5 pl 10xpCR buffer,
1.5plMgCl2 (2.5 mM),
1.0 nl引物M13-47 (10pmol/nl),
1.0 pi引物RV-M (10 pmol/pl),
2.0 dNTP (2.5 mM)，
0.15 pi Taq DNA polymerase (Promega),1.0 pl菌液
15.85 pl PCR-grade water<>
反应在PTC-100 PCR热循环仪(MJ Research)中进行，反应条件为94。C预变性5分钟，然后进入35个循环94。C变性30秒，59。C退火30秒，72。C延伸60秒。最后进行72。C延伸IO分钟。
实施实例2.
根据SEQ ID NO. 2对应的cDNA序列，设计含有限制性内切酶AWe I和屈o I酶切位点的特异性引物 F2 (CATATGACGTCTGTCCTGCACCACAATAA)和 R2
增编码Crustin-2成熟肽的基因片段，反应在PTC-100 Programmable Thermal Crontroller cycler(MJ Research)中进行，反应条件为94。C预变性5分钟；然后进行35循环包含94。C变性30秒，6(TC退火30秒，72'C延伸30秒；最后72'C延伸10分钟。然后将其克隆到pET30a(+)表达载体中，转化大肠杆菌origami (DE3),测序确认表达框正确后，接种阳性克隆到LB培养基中，37。C振荡培养至O.D6Q()=0.4-0.6，加入IPTG至终浓度为lmM诱导4小时后离心收集菌体。菌体用超声波200W处理30-60分钟(每次3秒，间隔3秒)。离心收集上清，利用Amersham公司的HiTrap chelating柱纯化重组产物。纯化后的产物利用梯度稀释法进行抑菌活性测定。以藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、四联微球菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌和鳗弧菌作为受试菌株检验表达产物的杀菌活性。将104-105的对数生长期受试菌在28'C培养24-36小时后，600nm测定细菌浓度。发现革兰氏阴性菌在所有Crustin-2试验浓度下都能正常生长，而革兰氏阳性菌只在含低浓度Crustin-2或者不含Crustin-2的LB培养基中生长。
实施实例3:重组表达产物在药物生产、饲料添加剂、防腐剂以及保鲜剂方面的应用。
7中华绒螯蟹Crustin-2基因及其体外重组表达SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院海洋研究所
〈120〉中华绒螯蟹Crustin-2基因及其体外重组表达
<130〉
〈140> 1
<141〉 2009-03-17
<歸 2
<170> Patervtln version 3. 5
<210〉 1
<211> 1255
<212〉 謹
<213> 中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)
<220>
〈221〉 CDS
<222〉 (31)..(369)
<400〉 1
ccccgggctg caggaattcg aattccaaaa atg aag gtg tgt ctg acc etc ctg 54
Met Lys Val Cys Leu Thr Leu Leu1 5
get acc tgc ctg ttg gtg ggg ctg age age ggc acg tct gtc ctg cac 102Ala Thr Cys Leu Leu Val Gly Leu Ser Ser Gly Thr Ser Val Leu His10 15 20
cac aat aac aaa ttc tgc ggc gac aac gtg ccc acc tec caa acc tat 150His Asn Asn Lys Phe Cys Gly Asp Asn Val Pro Thr Ser Gin Thr Tyr25 30 35 40
ggc tgc cgc tac ttc acc aag gac tac aac gac aaa tac gtg tgc gac 198Gly Cys Arg Tyr Phe Thr Lys Asp Tyr Asn Asp Lys Tyr Val Cys Asp45 50 55
agg aac cag aag ccc gag age acc tgc ccg cca ctt cgt ccc aca tgc 246Arg Asn Gin Lys Pro Glu Ser Thr Cys Pro Pro Leu Arg Pro Thr Cys60 65 70
acc agg aac ttc age ggc ggt ccc cct gtg gag tgc gtg acc gac aac 294Thr Arg Asn Phe Ser Gly Gly Pro Pro Val Glu Cys Val Thr Asp Asn75 80 85
gac tgc gcc tac age gac aag tgc tgc tgt gac get tgc etc gac cac 342Asp Cys Ala Tyr Ser Asp Lys Cys Cys Cys Asp Ala Cys Leu Asp His90 95 100
ccc gtc tgc aag ccc cct tat aac tag ataccccttc gtcccctctt 389Pro Val Cys Lys Pro Pro Tyr Asn中华绒螯蟹Crustin-2基因及其体外重组表达 105 110
taccccttcctataagcctctcggtaaccctaactctatcccttttgttt449
cctttttatccctcttttcagtcttgagataaccccaaactcccttttattctccctgtc509
tcccttttcaccttcctttagcttccatgtaaac t caaacgtccctacattccctttgtt569
ccctttaggtaac c 11 c aaactcctttccattccctgtgttgcctcttctttcttccctt629
tsgcttctatgtaaccctcatattccccttcattccctttgtccctcctctaggtaaccc689
ccgactcccttcccttccctttctaccctctactttctttcctttatagtcgtccggtac749
accccactctctcctccaacccctttgttcccttctctccctcctctttccgttcagtct809
ctaggt犯gcccagtcgcccctacctccatccctccctcctttctcccttcaaccgtatc869
ctccacacctgcccacaagcttttttattgtctttttttttttacaagggagtgactctt929
acgtaagctcatctacgctgttttgtcctctctgtcggcttgagtctttgtgtgtgttcc989
gggttgtctacgcatgtgaagtgttgcc已tgtgatttgttttgtgttgtggttgtcttaa1049
tgagtaatttacgaatgc犯gtgcatctggtatcctgtgtgtgtgtgtgt1109
gtgtgtgtgtgtgtgtacttaagggacttcctactgcggttcactttgatgtttcgagac1169
tggtttcggaacgtgtctcgcatctg犯tctcctctttatgttgttgttg1229
gtc鄉gg郞1255
〈210〉 2 〈211〉 112 <212〉 PRT
〈213〉 中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis) 〈400〉 2
Met Lys Val Cys Leu Thr Leu Leu Ala Thr Cys Leu Leu Val Gly Leu 15 10 15
Ser Ser Gly Thr Ser Val Leu His His Asn Asn Lys Phe Cys Gly Asp 20 25 30
Asn Val Pro Thr Ser Gin Thr Tyr Gly Cys Arg Tyr Phe Thr Lys Asp 35 40 45
Tyr Asn Asp Lys Tyr Val Cys Asp Arg Asn Gin Lys Pro Glu Ser Thr 50 55 60中华绒螯蟹Crustin-2基因及其体外重组表达 Cys Pro Pro Leu Arg Pro Thr Cys Thr Arg Asn Phe Ser Gly Gly Pro 65 70 75 80
Pro Val Glu Cys Val Thr Asp Asn Asp Cys Ala Tyr Ser Asp Lys Cys 85 90 95
Cys Cys Asp Ala Cys Leu Asp His Pro Val Cys Lys Pro Pro Tyr Asn 100 105 110
权利要求
1.一种中华绒螯蟹Crustin-2基因，其特征在于具有序列表SEDIQ No.1中的核苷酸基序列。
2. —种要求1所述的中华绒螯蟹Crustin-2基因编码蛋白，其特征在于具有序列表SEDIQNo.2中氨基酸序列。
3. —种权利要求2所述中华绒螯蟹Crustin-2的应用，其特征在于中华绒螯蟹Crustin-2基因的重组表达产物可作为抗菌剂应用于药物生产、饲料添加剂、防腐剂以及保鲜剂的生产。
全文摘要
本发明涉及分子生物学技术领域，是中华绒螯蟹Crustin-2的基因克隆及其重组表达技术。本发明利用表达序列标签(EST)技术、5’和3’末端快速扩增技术(RACE)从中华绒螯蟹中克隆到Crustin-2基因cDNA全长1255bp，包括一个339bp的开放阅读框，编码112个氨基酸，该基因在中华绒螯蟹免疫防御方面发挥着重要作用。重组Crustin-2蛋白具有显著的革兰氏阳性菌抑菌活性，对藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、四联球菌(Micrococcus tetragenus)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的最小抑菌浓度分别为0.093μM、0.19μM、0.37μM和0.093μM；而对革兰氏阴性菌没有明显抑菌活性。本发明可为进一步研究中华绒螯蟹免疫防御机制提供基础，并为中华绒螯蟹的病害防治、基因辅助选育和饲料添加剂开发奠定基础。
文档编号A61P31/04GK101565703SQ200910020030
公开日2009年10月28日 申请日期2009年3月25日 优先权日2009年3月25日
发明者宋林生, 母昌考, 王玲玲, 盖云超, 赵建民, 邱丽梅, 郑沛林 申请人:中国科学院海洋研究所