一种与中华绒螯蟹性早熟性状相关的snp标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种与中华绒螯蟹性早熟性状相关的SNP标记及其应用。该SNP位于蜕皮抑制激素基因MIH（AY310313.1）的3’‐UTR区，具体位置为3088bp处，碱基变异信息为SNP?A3088T?T>G。性状‐基因型关联性分析结果表明，该SNP变异与河蟹的性早熟性状之间存在着显著的相关性，其中GG基因型河蟹个体表现出性早熟性状的风险性较TT基因型个体高2.175倍。本发明河蟹性早熟相关基因的多态性SNP标记，可用于后续与河蟹性早熟性状相关的遗传育种研究。
【专利说明】一种与中华绒螯蟹性早熟性状相关的SNP标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学检测【技术领域】，涉及一种与中华绒螯蟹性早熟性状相关的SNP标记及其应用。
【背景技术】
[0002]中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)又称河蟹,是我国重要的甲壳类经济动物。长期以来，河蟹养殖过程中普遍存在着一龄蟹种的性早熟问题。性早熟幼蟹在培育过程中性腺当年发育成熟，这些性早熟蟹种不能顺利蜕壳，体重增长缓慢甚至停滞，绝大多数在翌年4~5月期间死亡，不能再继续饲养至2龄成蟹规格。性早熟一龄蟹的大量存在不仅造成饵料的巨大浪费，而且由于其外形与大规格蟹种较为相似，如果在挑选蟹种时不慎将性早熟个体用于后续商品蟹养殖，将给生产带来巨大的损失。目前的研究认为，河蟹性早熟的发生机制非常复杂，可能与内在的遗传因素和多种外部环境因素有关，但是其形成的确切机理还不清楚。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种与中华绒螯蟹性早熟性状相关的SNP标记。
[0004]本发明的另一目的是提供该SNP标记的应用。
[0005]本发明的目的可通过如下技术方案实现:
[0006]一种与中华绒螯蟹性早熟性状相关的SNP标记，该SNP位于蜕皮抑制激素基因MIH(Genbank登录号AY310313)的3’ - UTR区，具体位置为3088bp处，碱基变异信息为SNPA3088T T>G。
[0007]其中，所述的SNP标记，蜕皮抑制激素基因MIH3088bp处SNP位点GG基因型河蟹个体表现出性早熟性状的风险性显著高于TT基因型个体。
[0008]本发明所述的SNP标记在预测中华绒螯蟹性早熟风险中的应用。
[0009]一种预测中华绒螯蟹性早熟风险的方法，通过检测所述的SNP标记，预测中华绒螯蟹性早熟风险。
[0010]所述的预测中华绒螯蟹性早熟风险的方法，优选通过检测所述的SNP标记，该位点GG基因型河蟹个体表现出性早熟性状的风险性较TT基因型个体显著提高，从而预测中华绒螯蟹性早熟风险。
[0011]所述的预测中华绒螯蟹性早熟风险的方法，可进一步优选不同河蟹个体的基因组DNA,采用以PCR为基础的限制性片段长度多态法PCR - RFLP对不同个体进行基因分型，从而预测中华绒螯蟹性早熟风险。
[0012]所述的PCR-RFLP中使用的PCR上游引物为SEQ ID N0.1，下游引物为SEQ IDN0.2 ；使用的限制性内切酶为SspI限制性内切酶。
[0013]所述的PCR - RFLP中，酶切后进行电泳，GG基因在359b p处有特异性条带，TT基因型在192bp和167bp处有特异性条带，TG基因型在359bp、192bp以及167bp处有特异性条带。
[0014]所述的预测中华绒螯蟹性早熟风险的方法，还可进一步优选提取不同河蟹个体的基因组DNA，PCR扩增含有所述SNP标记的基因片段，通过直接测序获得所述SNP标记的序列，从而预测中华绒螯蟹性早熟风险。
[0015]用于鉴定本发明所述的SNP标记的PCR引物，上游引物为SEQ ID N0.1，下游引物为 SEQ ID N0.2。
[0016]有益效果:
[0017]本发明提供了一种与河蟹性早熟性状密切相关的SNP标记及其应用，其位于编码河蟹MIH基因序列的3’ -UTR区(T>G ;3088bp处)。性状-基因型关联性分析结果表明，该SNP变异与河蟹的性早熟性状之间存在着显著的相关性，其中GG基因型河蟹个体表现出性早熟性状的风险性较TT基因型个体高2.175倍。本发明河蟹性早熟相关基因的多态性SNP标记，可用于后续与河蟹性早熟性状相关的遗传育种研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1中华绒螯蟹SNP A3088T位点基因分型情况。
[0019]图1A.酶切后电泳图谱及测序结果,其中泳道I为marker ;泳道2为GG基因
[0020]型(359bp);泳道3和5为TT基因型(192bp ;167bp);泳道4为TG基因型(359bp ；
[0021]192bp以及167bp)。图1B.为三种基因型个体MIH基因PCR扩增产物经直接测序所得到的测序图谱。
【具体实施方式】
[0022]实施例1
[0023](I)检测方法:采用常规的酚氯仿法提取不同河蟹个体的基因组DNA，采用以PCR为基础的限制性片段长度多态法(PCR - RFLP)对不同个体进行基因分型；
[0024]PCR反应条件:
[0025]PCR 产物长度为 359bp，PCR 扩增引物为:F:CGTTCACCTCGTTTACCCAC(SEQ ID N0.1)；R:CCCTCAAACAGCTTTAGAGTT (SEQ ID N0.2)。PCR 反应体系为 20 μ L，其中包括:10XPCRBuffer2.5μ L,Mg2+ (2.5mmol/L)2.5 μ L, dNTP (2.5mmol/L)l.7 μ L，正反向引物各 0.75 μ L(10nmol/L),Taq酶0.2U,DNA模板I μ L (50ng/μ L),去离子双蒸水补足体积。PCR反应共计30个循环，循环前95°C预变性5min，每个循环包括94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s ;循环结束后于72°C延伸5min。扩增产物用I %的琼脂糖凝胶进行电泳检测合格后用于酶切。
[0026]酶切条件:
[0027]采用SspI限制性内切酶对上述PCR产物进行酶切，酶切体系为10 μ L，其中包括10 X NEB缓冲液I μ L，PCR产物5 μ L，SspI0.25 μ L，去离子双蒸水补足体积。37°C酶切过夜后用3%的琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，确定个体的不同基因型。
[0028]基因分型结果如图1所示。
[0029] (2)不同基因型个体与性早熟性状的相关性[0030]表1SNP A3088T与河蟹性早熟性状相关性的两阶段相关研究
[0031]
【权利要求】
1.一种与中华绒螯蟹性早熟性状相关的SNP标记，其特征在于该SNP位于蜕皮抑制激素基因MIH的3’ - UTR区，具体位置为3088bp处，碱基变异信息为SNPA3088T T>G。
2.根据权利要求1所述的SNP标记，其特征在于蜕皮抑制激素基因MIH3088bp处SNP位点GG基因型河蟹个体表现出性早熟性状的风险性显著高于TT基因型个体。
3.权利要求1或2所述的SNP标记在预测中华绒螯蟹性早熟风险中的应用。
4.一种预测中华绒螯蟹性早熟风险的方法，其特征在于通过检测权利要求1所述的SNP标记，预测中华绒螯蟹性早熟风险。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于通过检测权利要求1所述的SNP标记，该位点GG基因型河蟹个体表现出性早熟性状的风险性较TT基因型个体显著提高，从而预测中华绒螯蟹性早熟风险。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于提取不同河蟹个体的基因组DNA，采用以PCR为基础的限制性片段长度多态法PCR-RFLP对不同个体进行基因分型，从而预测中华绒螯蟹性早熟风险。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的PCR- RFLP中使用的PCR上游引物为SEQ ID N0.1，下游引物为SEQ ID N0.2 ;使用的限制性内切酶为SspI限制性内切酶。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于提取不同河蟹个体的基因组DNA，PCR扩增含有所述SNP标记的基因片段，通过直接测序获得所述SNP标记的序列，从而预测中华绒螯蟹性早熟风险。
9.用于鉴定权利要求1所述的SNP标记的PCR引物，其特征在于上游引物为SEQIDN0.1，下游引物为SEQ ID N0.2。
【文档编号】C12N15/11GK104004750SQ201410119022
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】许志强, 李跃华, 赵沐子, 丁淑燕, 潘建林 申请人:江苏省淡水水产研究所