专利名称：中华绒螯蟹EsSXL基因、其扩增引物组及扩增方法
技术领域：
本发明涉及基因克隆领域，特别涉及中华绒螯蟹&5忍基因，包括两种可变剪切体EsSXLl和EsSXL2,其扩增弓I物组及扩增方法。
背景技术：
中华绒螯蟹i^riocheirsirwnsis)属节肢动物门，甲壳纲，十足目，爬行亚目，短尾族，方蟹科，弓腿亚科，绒螫蟹属，俗称河蟹。河蟹是中国养殖产量最大的淡水蟹类，广泛分布于我国东南沿海的咸淡水或淡水水域中，其肉质鲜美，风味独特，营养丰富，深受广大群众的喜爱。我国自20世纪80年代初实现蟹苗批量生产以来，生产规模逐年扩大，2008年河蟹生产总量达到51. 84万吨，直接经济产值超过300亿元以上。甲壳类的性别调控机制 目前并不清楚，河蟹的雌性比雄性经济价值高，解决河蟹的性别分化及性别决定问题不仅具有重要的理论意义，同时也是产业实践的需要。性别致死基因(Sex lethal, 5JZ)是昆虫性别决定调控阶梯中的关键基因，5TZ基因的功能目前在果蝇中研究的比较清楚。5TZ对性别决定各阶梯的调控属于转录后调控，是通过对hnRNA的选择性剪切，产生不同的成熟mRNA而实现的。就果蝇而言，5TZ基因在雌雄个体内都有表达，但只有在雌性个体中存在有功能的形式，而雄性个体内的SXL mRNA前体在拼接时，第三外显子保留，而第三外显子中有一个终止子，从而在及Z mRNA翻译过程中引起提前终止，不能表达出完整有活性的SXL。通过同源比对，我们在Genbank数据库中发现甲壳类中存在性别致死基因SXL的同源基因或 EST 序列，例如-,Lepeophtheirus salmon is SXL 同源基因(accession number BT121101.1 和 BT077985.1)、日 if·艰资 iMacrobrachium nipponense) SXL 同源 EST 序列(accession number FL588338.1 和JK526786.1)等，这里我们首次在中华绒螯蟹中克隆了 5JZ基因(命名为必入并且发现有两种可变剪切体(splice variant和&5^之，这些结果为进一步研究以中华绒螯蟹为代表的经济甲壳类的性别决定机制奠定重要基础。
发明内容
本发明的目的是提供中华绒螯蟹&5TZ基因，包括两种可变剪切体&5TZ7和EsSXL2,其扩增弓I物组及扩增方法。本发明提供了中华绒螯蟹&5TZ基因，包括两种可变剪切体和其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 2所示。本发明还提供了用于扩增中华绒螯蟹&5TZ基因，包括两种可变剪切体和EsSXL2的引物组，&OZ7和共用一组扩增引物，其由如下引物组成
引物组
3'正向外引物3aEsSXL-Fl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示;
3'正向内引物3aEsSXL-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示;5'反向外引物5aEsSXL-Rl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示;
5'反向外引物5aEsSXL-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。本发明还提供了一种扩增中华绒螯蟹&5TZ基因，包括两种可变剪切体&5TZ7和的方法，包括如下步骤
步骤1:获得中华绒螯蟹精巢组织的总RNA ；
步骤2 :从GenBank中华绒螯蟹核酸数据库中筛选到 一个511bp的5TZ基因同源序列(GenBank accession number JR771373.1)，以此部分序列作为中间序列，根据此中间序列设计扩增&5忍基因的3'端和5'端片段的特异性引物组
3'正向外引物3aEsSXL-Fl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示;
3'正向内引物3aEsSXL-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示;
5'反向外引物5aEsSXL-Rl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示;
5'反向外引物5aEsSXL-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示;
步骤3 :以步骤I所得总RNA为模板，以所述的引物组为引物，通过PCR扩增中华绒螯^EsSXL基因的3'端和5'端片段；所述引物组由如下引物组成
步骤4 :将所述&5TZ基因中间序列、所述&5TZ基因的3'端和5'端片段拼接，即得。作为优选，步骤3所述扩增为套式两轮PCR。对所得序列用NCBI网站blastx在线分析，与序列一致性(Sequencesproducing significant alignments )最高的前100个序列都是SXL或SXL的同源蛋白，显著性检验达到极大(e〈lxl(T49),其中位居前列的包括甲壳类'Daphnia pulex (e<lxe_80)>Lepeoph theirus salmon is (e〈 Ixe-57)的 SXL 以及昆虫类物种的 SXL。EsSXL 氨基酸序列包含2个串联的RRM结构域，具有SXL蛋白的典型特征，综合这些信息，可以确定所得序列为中华绒螯蟹基因。把中华绒螯蟹&5TZ基因，包括两种可变剪切体和所编码的氨基酸序列与其他物种SXL氨基酸序列利用Clustalx1. 81软件进行序列比对分析和使用MEGA3.1软件构建NJ系统发育树(如图1)，由系统发育树可见，3种甲壳类SXL聚类在一个大的分支上，再与其他物种的SXL聚类。本发明以中华绒螯蟹精巢组织为材料，分离了中华绒螯蟹&5TZ基因全长cDNA序列，包括两种可变剪切体和利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、嵌套聚合酶链式反应(nested-PCR)、3,端cDNA快速扩增(3' RACE)以及V端cDNA快速扩增(5' RACE)的方法，对中华绒螯蟹&5忍基因进行了研究，首次从中华绒螯蟹精巢组织中克隆到了 &5TZ基因全长cDNA序列，包括两种可变剪切体和并对其所编码的&5忍的序列特征、同源性、进化地位进行了分析，这些结果为了解以中华绒螯蟹为代表的经济甲壳类的性别决定机制奠定重要基础。
图1为不同种类的动物SXL蛋白的NJ系统进化树；
图2为Y 端序列的2个可变剪切体EsSXLl和EsSXL2的PCR验证；
图S^EsSXL基因在不同组织中的表达谱。
具体实施例方式下面结合实施例，进一步阐述本发明。本发明中中华绒螯蟹由江苏盱眙河蟹养殖场提供，试剂均可由市场购得，RNA纯化等试剂购自美国Promega公司等，3' RACE和5' RACE试剂盒购自宝生物(大连)有限公司(Takara)0总RNA提取取IOOmg中华绒螯蟹精巢组织在研钵中加液氮研磨，用Trizol法提取总RNA, Trizol试剂采用Invitrogen公司，提取方法根据使用说明书。全长cDNA序列的克隆
从GenBank中华绒螯蟹核酸数据库中筛选到一个511bp的SXL基因同源序列(GenBankaccession number JR771373.1),以此部分序列作为中间序列，设计扩增基因的3' 端和5'端片段的特异性引物组，用于3'端和5'端快速扩增
3'正向外引物3aEsSXL-Fl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示; 3'正向内引物3aEsSXL-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示; 5'反向外引物5aEsSXL-Rl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示;
5'反向外引物5aEsSXL-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。EsSXL 基因 cDNA 3'端快速扩增(3' RACE )
根据况OZ基因中间序列，设计特异性3'正向外引物SaEsSXL-FUPSi正向内引物3aEsSXL-F2，其中，3'正向外引物3aEsSXL_Fl与:V RACE试剂盒中提供的:V RACE OuterPrimer组成引物对进行第一轮PCR扩增，对扩增产物用3'正向内引物3aEsSXL_F2和3,RACE Inner Primer进行第二轮PCR扩增，获得中华绒螯蟹&5TZ基因的Y端片段；
3' RACE Outer Primer 5/ TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT 3'
3' RACE Inner Primer 5/ CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG 3'
反转录
按照3' RACE试剂盒中的使用说明书进行，获得3'反转录液，反应体系如下:
权利要求
1.一种中华绒螯蟹&5TZ基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO. 2所示。
2.一组用于扩增如权利要求1所述的中华绒螯蟹&5TZ基因的引物组，其特征在于由如下引物组成 3'正向外引物3aEsSXL-Fl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示; 3'正向内引物3aEsSXL-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示; 5'反向外引物5aEsSXL-Rl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示; 5'反向外引物5aEsSXL-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
3.一种扩增如权利要求1所述的中华绒螯蟹&5TZ基因的方法，其特征在于包括如下步骤 步骤1:获得中华绒螯蟹精巢组织的总RNA ； 步骤2 :从GenBank中华绒螯蟹核酸数据库中筛选5JZ基因同源序列(GenBankaccession number JR771373.1),以此部分序列作为中间序列,根据此中间序列设计如权利要求2所述的引物组 步骤3 :以步骤I所得总RNA为模板，以步骤2所述的引物组为引物，通过PCR扩增中华绒螯蟹&5^1基因的3'端和5'端片段； 步骤4:将所述基因中间序列、所述基因的3'端和5'端片段拼接，即得。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤3所述扩增为套式两轮PCR。
全文摘要
本发明公布了一种中华绒螯蟹EsSXL基因、其扩增引物组及扩增方法。利用本发明提供的引物组从中华绒螯蟹精巢组织中克隆到了EsSXL基因全长cDNA序列，该基因包括两种可变剪切体EsSXL1和EsSXL2，对中华绒螯蟹EsSXL基因功能尤其在性别分化过程中的重要作用的研究奠定重要基础。
文档编号C12N15/10GK102994509SQ20121042253
公开日2013年3月27日 申请日期2012年10月29日 优先权日2012年10月29日
发明者沈怀舜, 周鑫, 柏爱旭, 任秀芳 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心