一种与中华绒螯蟹体重相关的snp标志及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，设及一种与中华绒馨蟹体重相关的SNP标志及其应 用。
【背景技术】
[0002] 中华绒馨蟹巧riocheirsisensis)又称为河蟹，是长江中下游地区重要的水产养 殖对象。自然条件下，河蟹一般为2年生，每年秋季成蟹徊游到出海的河口交配、产卵，第 二年3~5月解化，发育成幼蟹（大眼幼体、仔蟹、蟹种）后，再溯江河而上，在淡水中继续 发育长大为成蟹。一般而言，在河蟹养殖过程放养较大规格（体重）的蟹种可W获得较大 的成蟹捕拱规格。因此，在河蟹苗种培育过程中，大规格蟹种的市场需求一直较大，养殖效 益通常较好，其价格也相应最高。在之前的研究中，已有许多研究者尝试从蟹种培育池形状 (面积）、蟹苗投放密度、饲料投喂、水质调控、水草种植等各个方面探讨大规格蟹种的培育 模式，目前国内外尚未见蟹种规格（体重）相关分子标记开发及应用的相关报道。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是针对现有技术的上述空白，提供一种与中华绒馨蟹（蟹种）体重 相关的SNP标志及其应用。
[0004] 本发明的另一目的是提供该SNP标志的分子标记及其引物和应用。 阳〇化]本发明的目的可通过W下技术方案实现：
[0006] 与中华绒馨蟹体重相关的SNP标记，所述SNP标记位于河蟹蚁皮抑制激素基因MIH 的5'-侧翼区，具体位置为MIH基因的372bp处，碱基变异信息为SNP g. 372T〉C，该SNP位 点与中华绒馨蟹蟹种的体重性状之间存在着显著的相关性，其中CC基因型个体的平均体 重显著高于TT基因型个体的平均体重；所述的MIH基因Genbank检索号为AY310313。
[0007] 一种基于所述的SNP标记开发分子标记的方法，W含有所述的SNP标记的核巧酸 序列为基础序列，设计引物对，W中华绒馨蟹基因组DNA为模板进行PCR扩增，使所述的SNP 标记转化为分子标记。
[0008] 其中，所述的引物对序列为上游引物：SEQ ID NO :2,下游引物：SEQ ID NO :3 ;所述 的分子标记序列如SEQ ID NO :1所示，所述的SNP位点位于第126位，存在T/C多态性。
[0009] 按照上述的方法得到的分子标记。
[0010] 所述的分子标记序列优选如SEQ ID NO : 1所示，所述的SNP位点位于第126位，存 在T/C多态性。 W11] -种用于检测本发明所述的SNP标记的引物对，上游引物为：SEQ ID NO :2,下游 引物为：SEQ ID NO :3。
[0012] 一种检测所述的SNP标记的方法，包含PCR扩增中华绒馨蟹基因组中含有本发明 所述的SNP标记的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的T/C多态性。
[0013] 所述的方法优选包括W下步骤：
[0014] (1)取中华绒馨蟹的腿部肌肉并提取基因组DM ;
[001引 似用已提取的中华绒馨蟹基因组DNA为模板，使用权利要求6所述的引物进行 PCR扩增；
[0016] (3)将PCR扩增产物采用MboII限制性内切酶对所得到的PCR产物进行酶切，分析 酶切结果，根据酶切结果判断在SEQ ID NO :1第126位的T/C多态性。
[0017] 本发明所述的SNP标记、分子标记、引物在选育大规格中华绒馨蟹新品种中的应 用。
[0018] 一种选育大规格中华绒馨蟹新品种的方法，包括检测中华绒馨蟹MIH基因的 372bp处的基因型，选育该核巧酸位点为CC型的个体作为亲蟹。
[0019] 有益效果：
[0020] 河蟹等甲壳动物的生长是跳跃式的，通过蚁皮才能生长，蚁皮过程与其发育、生 长、繁殖、附肢再生等重要生理过程密切相连。本发明W河蟹蚁皮抑制激素基因（MIH)上 的单核巧酸多态位点为研究目标，发现位于MIH基因5' -侧翼区的一个SNP位点（SNP g. 372T〉C)与蟹种的体重性状之间存在着显著的相关性，其中CC基因型个体的平均体重显 著高于TT基因型（P<0. 05)个体。在W规格（体重）为选育指标的河蟹遗传育种研究过程 中，通过对河蟹育种群体进行SNP g. 372T乂基因分型，结合形态学特征分析，可W优先选择 基因型为CC的个体作为育种亲本，本研究对于选育大规格河蟹新品种具有重要的指导意 义。
【附图说明】 阳02U 图1. SNP g. 372T乂的基因分型图谱W及PCR产物直接测序验证图谱
[0022] 注：采用PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP)的方法进行基因分型，并通过 PCR产物直接测序的方法加W确认。电泳图谱中1号泳道为CC基因型，2号泳道为TT基因 型，3号泳道为CT基因型。
【具体实施方式】 阳〇2引实施例1
[0024] 采集处于同样培育条件下的不同规格蟹种300只W上，测量每只蟹种的外部形态 指标，其平均体重为：8. 26 + 3. 29g。从中随机取170只蟹种，取其腿部肌肉，采用酪氯仿法 提取其基因组DNA，采用WPCR为基础的限制性片段长度多态法（PCR-RFL巧对所有蟹种个 体进行基因分型。 阳0巧]①PCR反应
[0026] PCR产物扩增长度为224bp，PCR引物为：
[0027] 上游引物：5' -GCTTCAACAGGGGAACAGTC-3'（沈Q ID NO. 2);
[0028] 下游引物：5' -TTAGTTTGAGGACGCACGTG-3'（沈Q ID NO. 3)。
[0029] PCR扩增序列信息如SEQ ID NO. 1所示，其中第126位存在T/C多态性。
[0030] PCR 反应体系女曰下：10XPCR Buffer 6. 25yL，Mg化(2. 5mmol/L)6. 25yL， dNTP(2. 5mmol/L)3. 75 y L 正反向引物各 1 y L(10nmol/L)，Taq 酶 0. 5U，DNA 模板 1 y L (lOOng/ y U，双蒸水补足体积至50 y L。
[0031] PCR反应共计30个循环，循环前94°C预变性5min，每个循环包括94°C变性30s， 60°C退火30s，72°C延伸60s ;循环结束后于72°C延伸5min。
[0032] 扩增产物用1. 5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，检测合格后的PCR产物于-20°C保 存用于后续的酶切反应。
[0033] ②酶切条件
[0034] 采用MboII限制性内切酶对所得到的PCR产物进行酶化酶切体系包括10X肥B 缓冲液1 y LPCR产物5 y LMboII 0. 25 y L双蒸水补足体积至10 y L。37°C酶切过夜后用 2%的琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，W确定各个蟹种个体的基因型。
[0035] (3)不同基因型个体与蟹种体重的相关性分析
[0036] 对基因分型成功的所有蟹种的体重进行单因素方差分析，采用LSD法对表现出显 著性差异的不同基因型蟹种的体重进行两两比较，分析不同基因型与蟹种体重之间的相关 性。
[0037] 表1 MIH基因SNP g. 372T乂变异与蟹种体重的相关性
[0038]
[0039] 注：同列标注不同的字母表示差异显著（P<0. 05).
[0040] 结果表明，位于MIH基因5'-侧翼区的一个SNP位点（SNP g. 372T〉C)与蟹种的体 重性状之间存在着显著的相关性（表1)，其中CC基因型个体的平均体重显著高于TT基因 型个体（P<〇. 05)。
[0041] SNP g. 372T乂位点的PCR-RFLP基因分型及测序验证结果图示见图1。在W规格 (体重）为选育指标的河蟹遗传育种研究过程中，通过对河蟹育种群体进行SNP g.372T乂 基因分型，结合形态学特征分析，可W优先选择基因型为CC的个体作为育种亲本，本研究 对于选育大规格河蟹新品种具有重要的指导意义。
【主权项】
1. 与中华绒螯蟹体重相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记位于河蟹蜕皮抑制 激素基因MIH的5'-侧翼区，具体位置为MIH基因的372bp处，碱基变异信息为SNP g. 372 T>C，该SNP位点与中华绒螯蟹蟹种的体重性状之间存在着显著的相关性，其中CC基因型 个体的平均体重显著高于TT基因型个体的平均体重；所述的MIH基因Genbank检索号为 AY310313。2. -种基于权利要求1所述的SNP标记开发分子标记的方法，其特征在于，以含有权 利要求1所述的SNP标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以中华绒螯蟹基因组DNA 为模板进行PCR扩增，使权利要求1所述的SNP标记转化为分子标记。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的引物对序列为上游引物：SEQ ID NO :2,下游引物：SEQ ID NO :3;所述的分子标记序列如SEQ ID NO: 1所示，所述的SNP位点 位于第126位，存在T/C多态性。4. 按照权利要求2或3所述的方法得到的分子标记。5. 根据权利要求4所述的分子标记，其特征在于，分子标记序列如SEQ ID NO : 1所示， 所述的SNP位点位于第126位，存在T/C多态性。6. -种用于检测权利要求1所述的SNP标记的引物对，其特征在于，上游引物为：SEQ ID NO :2,下游引物为：SEQ ID NO :3。7. -种检测权利要求1所述的SNP标记的方法，其特征在于，包含PCR扩增中华绒螯蟹 基因组中含有权利要求1所述的SNP标记的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的 T/C多态性。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 取中华绒螯蟹的腿部肌肉并提取基因组DNA ; (2) 用已提取的中华绒螯蟹基因组DNA为模板，使用权利要求6所述的引物进行PCR扩 增； (3) 将PCR扩增产物采用MboII限制性内切酶对所得到的PCR产物进行酶切，分析酶切 结果，根据酶切结果判断在SEQ ID NO :1第126位的T/C多态性。9. 权利要求1所述的SNP标记、权利要求4或5所述的分子标记、权利要求6所述的引 物在选育大规格中华绒螯蟹新品种中的应用。10. -种选育大规格中华绒螯蟹新品种的方法，其特征在于，包括检测中华绒螯蟹MIH 基因的372bp处的基因型，选育该核苷酸位点为CC型的个体作为亲蟹。
【专利摘要】本发明公开了一种与中华绒螯蟹体重相关的SNP标志及其应用。与中华绒螯蟹体重相关的SNP标记，位于MIH基因的5’-侧翼区，具体位置为MIH基因的372bp处，碱基变异信息为SNP？g.372T>C，该SNP位点与中华绒螯蟹蟹种的体重性状之间存在着显著的相关性，其中CC基因型个体的平均体重显著高于TT基因型个体的平均体重。通过对河蟹育种群体进行SNP？g.372T>C基因分型，结合形态学特征分析，可以优先选择基因型为CC的个体作为育种亲本，本研究对于选育大规格河蟹新品种具有重要的指导意义。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105002171
【申请号】CN201510461189
【发明人】许志强, 陆全平, 董建昌, 李旭光, 邓燕飞, 徐宇, 葛家春, 潘建林
【申请人】江苏省淡水水产研究所, 南京建昌水产养殖专业合作社
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月30日