专利名称：中华绒螯蟹与日本绒螯蟹的分子遗传鉴别技术的制作方法
技术领域：
本发明属于遗传学、生物多样性保护学领域，更具体地，本发明涉及中华绒 螯蟹、中国南方水系(广东珠江、广西南流江)绒螯蟹与日本绒螯蟹的分子遗传 鉴别方法。
背景技术：
中华绒螯蟹(^Woc力ej'r幻'/3e; sis)和日本绒螯蟹(^rioc力eir j'apo/n'ca)同 属节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustaceae)、十足目(Decapoda)、方蟹 科(Grapsidae)、绒螯蟹属C&kc力e&)。绒螯蟹属通常包括四个种中华绒螯 蟹、日本绒螯蟹、直额绒螯蟹和狭额绒螯蟹。另外，中国南方水系还有南流江 绒螯蟹。直额绒螯蟹和狭额绒螯蟹个体很小，无经济价值。中华绒螯蟹和日本 绒螯蟹的个体较大，是经济性种类，其中中华绒螯蟹的经济价值最高，在中国 的年产值达300亿元以上。中华绒螯蟹是中国的土著种，主要分布于中国南至 北讳24° ，北至北讳42° 43° ，东至东经124。的鸭绿江口，西至东经112 °的湖北沙市的广大地区。日本绒螯蟹主要分布于日本和朝鲜半岛等地，而一 种观点认为中国南方的南流江水系(广西壮族自治区)、珠江水系(广东省)的绒 螯蟹也属日本绒螯蟹。本发明人将分布于日本的绒螯蟹归为日本绒螯蟹，将中 国南流江水系(广西壮族自治区)、珠江水系(广东省)的绒螯蟹归为南方绒螯 蟹。
由于中华绒螯蟹的巨大经济价值和市场潜力，目前已形成了规模庞大的产 业。随着中华绒螯蟹产业的飞速发展，出现了不同水系绒螯蟹苗种相互混杂、 交流的现象。因此研究和开发不同水系絨螯蟹的鉴别方法与技术对产业发展至 关重要。
从形态标记上1999年《水产学报》23巻第4期337-342报道了中国北 方四水系(辽河、黄河、长江、瓯江)和南方两水系(珠江、南流江)六个绒鳌蟹 群体形态多元分析结果，提供了判别南北水系绒螯蟹准确率达100%的判别函数；2002年《上海水产大学学报》第11巻第2期110-113页报道了一只日本 绒螯蟹样本与中国不同水系中华绒螯蟹的形态描述性区别方法；2003年《大连
水产学报学报》第18巻第4期273-276对IO只日本绒螯蟹与一只中华绒螯蟹 的形态主成分分析，发现两者存大明显的形态差异。在形态标记上，形态性状 的可塑性较大，存在一定的测量主观性差异。
从核型标记上1986年《动物学研究》第7巻第3期293-296页报道中 华绒鳌蟹的染色体为146(2n=146， n=73) 。 2004年《Fisheries Science》第 70巻21卜214报道的中华绒螯蟹和日本绒螯蟹的染色体数目均为146(2n=146， n=73)，认为从染色体水平上不能鉴别这两种绒螯螯。
从生化遗传标记上1999年《水产学报》23巻第4期331-336对辽河， 黄河，长江，瓯江，珠江，南流江等六个绒鳌蟹群体的17种同工酶进行了电 泳分析，发现辽河，黄河，长江，瓯江水系绒鳌蟹与珠江、南流江水系绒鳌蟹 在SOD同工酶表型上有明显差异，SOD-2位点仅在辽河，黄河，长江中华绒鳌 蟹中表达，而S0D-4位点仅在珠江和南流江水系的绒鳌蟹中表达，这些可作为 中国南北绒鳌蟹区分的生化遗传标志。
从分子遗传标记上1999年《水产学报》23巻第4期3257-3302用RAPD 标记发现引物Z2扩增的830bp片断为珠江蟹和南流江蟹所特有，700bp片断则 为长江蟹，辽河蟹，黄河蟹所特有，南北两大区域的绒鳌蟹存在截然不同的分 子标记；2002年《自然科学进展》第12巻第5期485-490页对长江、辽河、 瓯江、闽江、九龙江(福建)和南流江绒螯蟹16SrDN的PCR/RFLP分析结果，发 现两个单倍型可作为鉴定长江水系中华绒螯蟹与南流江水系绒螯蟹的分子遗 传标记；2005年《动物学报》第51巻第5期862-866页对中华绒螯蟹与合浦 绒螯蟹两地理亚种的线粒体DNA序列变异进行了研究，发现中华绒螯蟹与合浦 绒螯蟹两亚种在17条Cyt b全序列上以40个固定的碱基变异位点相区别。
以上背景资料均为中国不同水系的绒螯蟹研究，均未包括分布于日本河流 中的日本绒螯蟹。2000年《水产学报》第24巻第5期412-416页分析了中华 绒鳌蟹与日本绒鳌蟹的线粒体12SrRNA基因片段，发现了区别这两种绒鳌蟹的 5个变异位点。2001年《青岛海洋大学学报》，第31巻第6期861-866页报 道了中华绒螯蟹与日本绒螯蟹的线粒体COI基因序列差异，但只分析了 2只中 华绒螯蟹样本，日本绒螯蟹的序列采自GeneBank中收录的序列。但二项背景 资料中并未分析中国南方水系，尤其是南流江水系的绒螯螯。目前本领域还没有
公开日本绒螯蟹以及中国南方水系绒螯蟹线粒体con的序列。
综上，目前尚缺乏鉴别绒螯蟹的不同物种/地理群体的分子标记技术和方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴定绒螯蟹，特别是中华绒螯蟹、中国南方水系 绒螯蟹和/或日本绒螯蟹的方法。
本发明的目的还在于提供中华绒螯蟹、中国南方水系绒螯蟹和日本绒螯蟹的 基因序列及其用途。
在本发明的第一方面，提供一种绒螯蟹线粒体COII基因的用途，用于鉴定中
华绒螯蟹、日本绒螯蟹、和/或中国南方水系绒螯蟹。
在另一优选例中，所述的绒螯蟹线粒体COII基因具有SEQIDNO: 1、 SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的中国南方水系绒螯蟹是广西南流江、广东珠江绒螯蟹。
在本发明的第二方面，提供一种鉴定中华绒螯蟹、日本绒螯蟹、和/或中国南方 水系绒螯蟹的方法，所述方法包括
(1) 测定待测绒螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列中选自以下的至少一个位 点的碱基第78位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450位、第 579位、第594位或第612位；
若所述至少一个位点的碱基与SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列中相同位点的 碱基全部相同，则该待测绒螯蟹是中华绒螯蟹；否则，进行步骤(2);
(2) 测定待测绒螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列中选自以下的至少一个位 点的碱基第45位、第135位、第156位、第186位、第315位、第531位、第 564位、第600位或第612位；
若所述至少一个位点的碱基与SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列中相同位点的 碱基全部相同，则该待测绒螯蟹是日本绒螯蟹；否则， 该待测绒螯蟹是中国南方水系绒螯蟹；或者，所述方法包括-
(r)测定待测绒螯蟹的线粒体con基因的核苷酸序列中选自以下的至少一个
位点的碱基第45位、第135位、第156位、第186位、第315位、第531位、 第564位、第600位或第612位；
若所述至少一个位点的碱基与SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列中相同位点的 碱基不同，则该待测绒螯蟹是中国南方水系绒螯蟹；否则，进行步骤(2');
(2')测定待测绒螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列中选自以下的至少一个 位点的碱基第78位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450位、 第579位、第594位或第612位；
若所述至少一个位点的碱基与SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列中相同位点的 碱基全部相同，则该待测绒螯蟹是中华绒螯蟹；否则，该待测绒螯蟹是日本绒螯蟹。
在另一优选例中，通过聚合酶链反应(PCR)获得待测绒螯蟹的线粒体COII基因。
在另一优选例中，采用以下引物对进行聚合酶链反应 具有SEQIDNO:4所示核苷酸序列的引物；和 具有SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列的引物。
在另一优选例中，在步骤(1)或步骤(2)或步骤(1')或步骤(2')中，测定待测绒螯蟹 的线粒体COII基因的核苷酸序列中的至少两个所列位点的碱基。
更优选的，测定至少3个所列位点的碱基，进一步优选的，测定3个以上所列 位点的碱基；最优选的，测定所有所列位点的碱基。
在另一优选例中，碱基位数从绒螯蟹线粒体COII基因的"ATG"密码子起算， 以碱基"A"为第l位。
在本发明的第三方面，提供一种鉴定中华绒螯蟹、日本绒螯蟹、和/或中国南方 水系绒螯蟹的方法，所述方法包括-
测定待测絨螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列， 若其具有SEQIDNO: 1所示的序列，则该待测絨螯蟹是中华绒螯蟹； 若其具有SEQ ID NO: 2所示的序列，则该待测绒螯蟹是中国南方水系绒螯蟹； 若其具有SEQ ID NO: 3所示的序列，则该待测絨螯蟹是日本绒螯蟹。在本发明的第四方面，提供一种试剂盒，所述的试剂盒用于鉴定中华绒螯蟹、 日本绒螯蟹、和/或中国南方水系绒螯蟹，并且所述试剂盒中含有
容器，以及位于容器中的可特异性扩增绒螯蟹线粒体COII基因的引物。 在另一优选例中，所述的试剂盒中含有-
容器a，以及位于容器a中的具有SEQIDNO:4所示核苷酸序列的引物；和 容器b，以及位于容器b中的具有SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列的引物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。
具体实施例方式
针对目前不同水系绒螯蟹相互混杂、交流的现象，本发明人经过广泛的研 究，首次揭示一种鉴别中华绒螯蟹、日本绒螯蟹和中国南方水系绒螯蟹的方法。 采用所述的方法可有效、准确地进行鉴别，所需的样本量少。并且，采用所述 方法，可在蟹苗时期就准确地鉴定出属于哪种绒螯蟹，择优养殖，从而为中国 河蟹产业提供种源保障。在此基础上完成了本发明。
鉴定方法
技术领域：
本发明基于不同种绒螯蟹之间线粒体COII基因的单核苷酸多态性(SNP) 而实现。本发明人发现，绒螯蟹的线粒体COII基因中的一些碱基位点可准确 地反映不同种的绒螯蟹之间的差异，而在同一种中保持特别高的稳定性，即使 是在属于同一种的不同群体(例如来自不同的水系的同种绒螯蟹)之间也是非常 稳定的。因而，通过鉴别绒螯蟹线粒体COII基因上一个或多个特定碱基就可 准确地得知该绒螯蟹的种类。
因此，本发明提供了一种鉴定中华绒螯蟹、日本絨螯蟹、中国南方水系绒螯 蟹的方法，所述方法包括检测待测蟹的线粒体COII基因中以下位点的一个 或多个第45位、第78位、第135位、第156位、第186位、第231位、第 270位、第315位、第375位、第402位、第450位、第531位、第564位、 第579位、第594位、第600位、第612位、第621位的碱基，通过分析所述 位点上碱基的多态性情况，从而得知待测蟹的品种。作为本发明的优选方式，以SEQIDNO: l所示的核苷酸序列(即中华绒螯蟹
的COII基因序列)作为参照来进行比较，所述方法包括
(1) 测定待测绒螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列中选自以下的至少一 个位点的碱基第78位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450 位、第579位、第594位或第612位；
若所述至少一个位点的碱基与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中相同位点 的碱基全部相同，则该待测绒螯蟹是中华绒螯蟹；否则进行步骤(2);
(2) 测定待测绒螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列中选自以下的至少一 个位点的碱基第45位、第135位、第156位、第186位、第315位、第531 位、第564位、第600位或第612位；
若所述至少一个位点的碱基与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中相同位点 的碱基全部相同，则该待测绒螯蟹是日本绒螯蟹；否则，该待测绒螯蟹是中国 南方水系绒螯蟹；
或者，所述方法包括
(1，)测定待测绒螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列中选自以下的至少一 个位点的碱基第45位、第135位、第156位、第186位、第315位、第531 位、第564位、第600位或第612位；
若所述至少一个位点的碱基与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中相同位点 的碱基不同，则该待测绒螯蟹是中国南方水系绒螯蟹；否则，进行步骤(2');
(2')测定待测绒螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列中选自以下的至少一 个位点的碱基第78位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450 位、第579位、第594位或第612位；
若所述至少一个位点的碱基与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中相同位点 的碱基全部相同，则该待测绒螯蟹是中华绒螯蟹；否则，该待测绒螯蟹是曰本 绒螯蟹。
作为本发明的另一优选方式，还可以SEQIDNO:2所示的核苷酸序列(即中 国南方水系绒螯蟹的COII基因序列)作为参照来进行比较，所述方法包括
(1)测定待测绒螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列中选自以下的至少一 个位点的碱基第45位、第135位、第156位、第186位、第315位、第531 位、第564位、第600位或第612位；SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中相同位点 的碱基全部相同，则该待测絨螯蟹是中国南方水系绒螯蟹；否则，进行步骤(2);
(2)测定待测绒螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列中选自以下的至少一 个位点的碱基第78位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450 位、第579位、第594位或第612位；
若所述至少一个位点的碱基与SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列中相同位点 的碱基全部相同，则该待测绒螯蟹是日本绒螯蟹；否则，该待测绒螯蟹是中华 绒螯蟹；
或者，所述方法包括
(r)测定待测绒螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列中选自以下的至少一 个位点的碱基第78位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450 位、第579位、第594位或第612位；
若所述至少一个位点的碱基与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中相同位点 的碱基不同，则该待测绒螯蟹是中华绒螯蟹；否则，进行步骤(2');
(2，)测定待测绒螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列中选自以下的至少一 个位点的碱基第45位、第135位、第156位、第186位、第315位、第531 位、第564位、第600位或第612位；
若所述至少一个位点的碱基与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中相同位点 的碱基全部相同，则该待测绒螯蟹是中国南方水系絨螯蟹；否则，该待测绒螯 蟹是日本绒螯蟹。
作为本发明的另一优选方式，还可以SEQIDNO:3所示的核苷酸序列(即日
本绒螯蟹的con基因序列)作为参照来进行比较，所述方法包括-
(1) 测定待测绒螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列中选自以下的至少一 个位点的碱基第45位、第135位、第156位、第186位、第315位、第531 位、第564位、第600位或第612位；
若所述至少一个位点的碱基与SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列中相同位点 的碱基不同，则该待测絨螯蟹是中国南方水系绒螯蟹；否则，进行步骤(2);
(2) 测定待测绒螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列中选自以下的至少一 个位点的碱基第78位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450 位、第579位、第594位或第612位；若所述至少一个位点的碱基与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列中相同位点 的碱基全部相同，则该待测绒螯蟹是日本绒螯蟹；否则，该待测绒螯蟹是中华 绒螯蟹；
或者，所述方法包括
(1，)测定待测绒螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列中选自以下的至少一 个位点的碱基第78位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450 位、第579位、第594位或第612位；
若所述至少一个位点的碱基与SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列中相同位点 的碱基不同，则该待测绒螯蟹是中华绒螯蟹；否则，进行步骤(2');
(2')测定待测绒螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列中选自以下的至少一 个位点的碱基
若所述至少一个位点的碱基与SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列中相同位点 的碱基全部相同，则该待测绒螯蟹是日本绒螯蟹；否则，该待测绒螯蟹是中国 南方水系绒螯蟹。
从进一步提高鉴定的准确性考虑，作为本发明的优选方式，在测定待测绒螯 蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列中所列碱基时，优选的是测定至少两个所列 位点(即从第45位、第135位、第156位、第186位、第315位、第531位、 第564位、第600位或第612位中至少选择两个位点进行检测；以及从第78 位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450位、第579位、第594 位或第612位中至少选择两个位点进行检测)的碱基。更优选的，测定至少3个 所列位点的碱基，进一步优选的，测定3个以上所列位点的碱基；最优选的，测定 所有所列位点的碱基。
在本发明中，各多态性位点的碱基位数从绒螯蟹线粒体COII基因的ATG 密码子起算，以该密码子的第l个碱基"A"为第l位。
各种可鉴定COII基因中特定位点碱基的方法均被包括在本发明中。作为本 发明的优选方式，也可选择以下方法进行鉴定从以下第一组中选择至少一个位点的碱基，以及从以下第二组中选择至少一个位点的碱基；通过分析待测蟹 的COII基因中所选择的至少两个位点的碱基，并与表1所示核苷酸变异位点 (见实施例5)比较，来判断待测蟹的种类。
第一组碱基第45位、第135位、第156位、第186位、第315位、第531 位、第564位、第600位或第612位；
第二组碱基第78位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450 位、第579位、第594位或第612位。
制备待测蟹的基因组DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可 采取传统的酚-氯仿法。
PCR扩增是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异 DNA片段。本发明的方法可采用常规的PCR技术进行。
作为本发明的优选方式，可通过提取待测绒螯蟹的DNA，设计可扩增引物 线粒体COII基因的引物，从而扩增出线粒体COII基因的序列；然后对扩增产 物电泳检测、纯化、克隆；最后测序并取序列分析，从而找出区别不同绒螯蟹 的SNP差异位点进行鉴别与判断。
作为本发明的优选方式，采用简并性引物进行扩增，所述的简并性引物是由 具有SEQ ID NO: 4所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO: 5所示核苷酸序 列的引物构成的引物对。使用该引物对可特异性从中华绒螯蟹、日本绒螯蟹以 及中国南方水系绒螯蟹基因组DNA中特异性扩增出COII序列，并且扩增情况 良好，扩增产物多且稳定。
另一方面，基于本发明所提供的中华绒螯蟹、日本绒螯蟹和/或中国南方水 系绒螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列，本领域技术人员也可通过直接测 定待测蟹的COII基因的核苷酸序列而得知待测蟹的种类。若待测蟹的COII具 有SEQIDNO: l所示的序列，则是中华绒螯蟹；若待测蟹的COII具有SEQ ID NO:2所示的序列，则是中国南方水系绒螯蟹；若待测蟹的COII具有SEQ ID NO: 3所示的序列，则是日本绒螯蟹。
本发明的方法可以鉴定各种生长时期的绒螯蟹，包括蟹苗。试剂盒
本发明还涉及一种用于鉴定中华绒螯蟹、日本绒螯蟹和/或中国南方水系绒 螯蟹的试剂盒，所述试剂盒中含有
容器，以及位于容器中的可特异性扩增绒螯蟹线粒体COII基因的引物。 作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中含有
容器a，以及位于容器a中的具有SEQ ID NO: 4所示核苷酸序列的引物；
禾口
容器b，以及位于容器b中的具有SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列的引物。 每种引物或探针均被置于独立的容器中。
此外，所述的试剂盒还可含有其它鉴定待测蟹所需的试剂，如(但不限于)
(A) 各种PCR反应用试剂，例如但不限于PCR缓冲液，dNTP， DNA聚 合酶等；或
(B) 各种提取蟹DNA(即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如但不限于 酚、氯仿等；或
(C) 进行琼脂糖凝胶电泳所需的试剂，例如但不限于琼脂糖粉、电泳缓冲 液、溴化乙啶等。
此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定待测蟹的使用说明书，从而指导技术人 员正确使用所述试剂盒。
所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测待测蟹的目的。
本发明的主要优点在于
(1) 首次揭示可有效鉴别中华绒螯蟹、日本绒螯蟹和中国南方水系绒螯蟹 的方法。采用所述的方法可有效、准确地进行鉴别，所需的样本量少。并且， 采用所述方法，可在蟹苗时期就准确地实施鉴定，择优养殖，从而为河蟹产业 提供了更好的种源保障。
(2) 本发明提供的可用于鉴别中华绒螯蟹、日本绒螯蟹和中国南方水系绒螯 蟹的线粒体COII基因中的碱基位点可准确地反映不同种的绒螯蟹之间的差异， 而在同一种中保持稳定，即使是在属于同一种的不同群体(例如来自不同的水系 的同品种绒螯蟹)之间也是稳定的。
(2)本发明为鉴别不同地域来源的中华絨螯蟹、中国南方水系绒螯蟹和/或日本绒螯蟹提供了一种有效、准确的群体鉴别与检测技术。从而克服了目前存 在的不同水系绒螯蟹相互混杂、交流的问题。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉 的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本 发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例l.样本选择
选择来自不同水系中华绒螯蟹样本共125只，来自中国南方水系(广西南 流江和广东珠江)绒螯蟹样本40只，来自日本北海道地区的日本绒螯蟹样本 15只，用于后续试验。本发明人选择了足够数量的绒螯蟹，因此获得的结果具 有统计学意义，准确可靠。
实施例2. DNA提取
取每只蟹第三步足的长节肌肉0.2g，装入1.5ml的离心管中，加入40(HxL STE缓冲液(30mmol/L Tris-HC1， p朋.0, 200mmol/L EDTA， 50mmol/L NaCl)。 混匀后加入浓度为10yQ的SDS90pL和20mg/mL的蛋白酶K10nL， 55。C消化8 10h;加入等体积饱和酚于转轮上缓慢转动lh， 10， 000r/min离心8min，吸取 上清液加入等体积的混合液(酚氯仿异戊醇=25 : 24 : 1);缓慢转动30min， 10， 000r/inin离心8min，取上清液加入等体积的氯仿和异戊醇混合液(氯仿 异戊醇=24: 1)，缓慢转动5 min， 10, 000r/min离心5min，取上清液后，加 入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，再用70%的乙醇洗涤，干燥，加入300pL的 TE液溶解备用。
实施例3. PCR扩增与产物克隆、测序
根据2001年南京师范大学学报自然科学版第24巻4期485-490页报道的中华绒螯蟹线粒体con基因序列，设计的一对用于扩增con基因的简并性引
物为
COII-F: 5' -CATCACCTTGTCAAGGTGAAA-3'(SEQ ID NO: 4); COII-R: 5' - CATGGTCAGTCTCAGGATTCA-3'(SEQ ID NO: 5)。
以实施例1制备的蟹基因组DNA为模板，以上述COII-F、 COII-R为引物， 进行PCR扩增。PCR反应体积为50pL，内含5pL PCR缓冲液(lOmmol/L Tris-HCL， pH9. 0， 50mmol/L KCL， 30mmol/L MgCL2， 0. 01%的明胶)，2(iL dNTP混合液(每 种dNTP 0.1 mmol/L)， 4(iL的引物(0. 2(imol/L), 2fiL基因组DNA(50ng/|il)， 2|uL Taq酶(2 IU) ， 35jliL的蒸馏水。
扩增反应条件为94。C预变性5min，接下来进行30个循环，每个循环包 括94。C 30s， 54°C 30s， 72°C lmin， 30个循环后，72。C延伸5min。
实施例4.产物克隆、测序
扩增的目的基因产物以常规的琼脂糖电泳回收后，纯化，连接插入载体 pUC18，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a ，筛选重组子进行内切酶酶切和PCR检验。
然后，选取重组子于3730型Bigdye-Terminator全自动测序仪上进行测序。 测序结果显示，中华绒螯蟹具有SEQ ID NO: l所示的核苷酸序列；中国南方 水系绒螯蟹具有SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列；日本绒螯蟹具有SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。
实施例5.筛选核苷酸变异位点
用BioEdit软件对测序结果进行重排和同源比较，以转录起始位点ATG(前 三位核苷酸)中碱基A为位数计算的起点，然后根据位点差异鉴定不同绒螯蟹。 结果如表l所示。_表l.核苷酸变异位点_
起始位点ATG 第45bp第78bp第135bp第156bp第186bp第231bp 中华绒鳌蟹 T T G C A T
南方水系绒螯蟹C C A T G C
日本绒螯蟹 T C G C A C
起始位点ATG 第270bp第315bp第375bp第4Q2bp第450bp第531bp 中华绒鳌蟹 A T T G C G
南方水系绒螯蟹 G C C A T A
日本绒螯蟹 G T C A T G
起始位点ATG 第564bp第579bp第594bp第600bp第612bp第621bp
中华绒鳌蟹ACACCG
南方水系绒螯蟹GTGTTA
曰本绒螯蟹ATGCCA
实施例6.待测蟹的鉴定
方法l.选择两个多态位点进行鉴定
根据表1结果可鉴别待测的蟹属于哪种绒螯蟹。
如实施例2、实施例3和实施例4所述的方法提取待测蟹的DNA，进行PCR 扩增，扩增产物测序。
检测扩增产物的序列中第45位和78位的碱基，若第45位和第78位均是T， 则该待测蟹是中华绒螯蟹；若第45位和第78位均是C，则该待测蟹是中国南 方水系绒螯蟹；若第45位为T而第78位是C，则该待测蟹是日本绒螯蟹。
方法2.以SEQIDN0: 1的序列为参照进行鉴定
如实施例2、实施例3和实施例4所述的方法提取待测蟹的DNA，进行PCR 扩增，扩增产物测序。
检测扩增产物的序列中第45位的碱基，并与SEQ ID N0: 1所示序列的第45位碱基比较，若待测蟹的该碱基不同于SEQ ID NO: l所示序列的第45位碱 基，则该待测蟹是中国南方水系绒螯蟹；若待测蟹的该碱基与SEQ ID NO: 1 所示序列的第45位碱基相同，则该待测蟹是中华絨螯蟹或日本绒螯蟹，需要 进行进一步鉴定
选择扩增产物中第78位碱基，并与SEQ ID NO: l所示序列的第78位碱基 比较，若待测蟹的该碱基与SEQ ID NO: 1所示序列的第78位碱基相同，则该 待测蟹是中华绒螯蟹；若待测蟹的该碱基与SEQ ID NO: l所示序列的第78位 碱基不同，则该待测蟹是日本绒螯蟹。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。序列表
<110>李思发
<120>中华绒螯蟹与日本绒螯蟹的分子遗传鉴别技术
<130〉 075326
<160> 5
<170> Patentln version 3. 3
<210> 1
<211> 693
<212〉 DNA
<213〉 绒螯蟹属(Eriocheir)
<400〉 1
atggcaacatgagcgtatttgacagagcttctcctcttat agaacaatta60
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〈400〉 2
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〈211〉 21
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<213〉 人工序列
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<221〉 misc—feature
<223〉 引物
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<211〉 21
<212> DNA <213>人工序列
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<221> misc—feature
<223〉 引物
<400> 5
catggtcagt ctcaggattc a 2权利要求
1. 一种绒螯蟹线粒体COII基因的用途，其特征在于，用于鉴定中华绒螯蟹、日本绒螯蟹、和/或中国南方水系绒螯蟹。
2. 如权利要求i所述的用途，其特征在于，所述的绒螯蟹线粒体con基因具有SEQ ID NO: 1 、 SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。
3. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的中国南方水系绒螯蟹是 广西南流江、广东珠江绒螯蟹。
4. 一种鉴定中华绒螯蟹、日本绒螯蟹、和/或中国南方水系绒螯蟹的方法，其特征在于，所述方法包括(1) 测定待测绒螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列中选自以下的至少一个 位点的碱基第78位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450位、 第579位、第594位或第612位；若所述至少一个位点的碱基与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中相同位点的 碱基全部相同，则该待测绒螯蟹是中华绒螯蟹；否则，进行步骤(2);(2) 测定待测绒螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列中选自以下的至少一个 位点的碱基第45位、第135位、第156位、第186位、第315位、第531位、 第564位、第600位或第612位；若所述至少一个位点的碱基与SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列中相同位点的 碱基全部相同，则该待测绒螯蟹是日本绒螯蟹；否则， 该待测绒螯蟹是中国南方水系绒螯蟹-, 或者，所述方法包括(r)测定待测绒螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列中选自以下的至少一个 位点的碱基第45位、第135位、第156位、第186位、第315位、第531位、 第564位、第600位或第612位；若所述至少一个位点的碱基与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中相同位点的 碱基不同，则该待测绒螯蟹是中国南方水系绒螯蟹；否则，进行步骤(2');(2')测定待测绒螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列中选自以下的至少一个 位点的碱基第78位、第231位、第270位、第375位、第402位、第450位、第579位、第594位或第612位；若所述至少一个位点的碱基与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中相同位点的 碱基全部相同，则该待测绒螯蟹是中华绒螯蟹；否则，该待测绒螯蟹是日本绒螯蟹。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，通过聚合酶链反应获得待测绒螯 蟹的线粒体COII基因。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，采用以下引物对进行聚合酶链反应具有SEQIDNO:4所示核苷酸序列的引物；和 具有SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列的引物。
7. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(1)或步骤(2)或步骤(1，)或 步骤(2')中，测定待测绒螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列中的至少两个所列 位点的碱基。
8. —种鉴定中华绒螯蟹、日本绒螯蟹、和/或中国南方水系绒螯蟹的方法，其 特征在于，所述方法包括测定待测绒螯蟹的线粒体COII基因的核苷酸序列， 若其具有SEQ ID NO: 1所示的序列，则该待测绒螯蟹是中华绒螯蟹； 若其具有SEQ ID NO: 2所示的序列，则该待测绒螯蟹是中国南方水系绒螯蟹; 若其具有SEQ ID NO: 3所示的序列，则该待测绒螯蟹是日本绒螯蟹。
9. 一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒用于鉴定中华绒螯蟹、日本绒螯 蟹、和/或中国南方水系絨螯蟹，并且所述试剂盒中含有容器，以及位于容器中的可特异性扩增绒螯蟹线粒体COII基因的引物。
10. 如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有 容器a，以及位于容器a中的具有SEQIDNO:4所示核苷酸序列的引物；和 容器b，以及位于容器b中的具有SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列的引物。
全文摘要
本发明属于遗传学、生物多样性保护学领域，公开了一种线粒体COII基因在鉴定中华绒螯蟹、日本绒螯蟹和/或中国南方水系绒螯蟹中的用途。本发明还公开了鉴别中华绒螯蟹、日本绒螯蟹和/或中国南方水系绒螯蟹的方法，采用所述的方法可有效、准确地进行鉴别，所需的样本量少，从而为蟹的遗传判别和良种养殖提供了更理想的途径。
文档编号C12N15/11GK101418336SQ20071004732
公开日2009年4月29日 申请日期2007年10月23日 优先权日2007年10月23日
发明者李思发, 王成辉 申请人:李思发