专利名称：一种快速筛选牛奶类液体样中抗菌药物残留的方法
技术领域：
本发明涉及抗菌药物残留检测分析技术领域，具体地说属于一种利用细 菌的生长受到被检样品中残留的抗菌药物抑制而快速筛选牛奶类液体样品中 抗菌药物残留的方法。
背景技术：
抗菌药物残留一直是困扰食品安全的严重问题，奶牛养殖场广泛应用抗 菌药物治疗各种感染性疾病因而容易造成牛奶中的药物残留。现在用于检测 牛奶中抗菌药物的方法主要有高效液相色谱法、液相-质谱联用分析法、气相 -质谱联用分析法、薄层色谱法等色谱方法。这些色谱方法存在的主要缺陷是: 需要专业仪器设备；样品预处理程序繁琐；操作过程复杂；耗时冗长；需要 专业培训的技术人员进行操作；干扰因素多；分析仪器昂贵；在基层难以普 及， 一般只适用于实验室检测；检测费用高。免疫学检测法也用于抗菌药物 在牛奶中的残留检测，但一种试剂盒一般只能检测一种抗菌药物、易受干扰 而出假阳性，耗材成本高。
微生物法检测抗菌药物残留是根据抗菌药物对微生物的生理机能、代谢 的抑制作用，来定性或定量确定样品中药物残留，具有快速、敏感、廉价等 优点。目前，牛奶等液体样的抗菌药物残留微生物检测法主要有氯化三苯基 四氮唑法，并已列入国家标准。但该方法的具体操作过程中，加入检测牛奶 中的嗜热链球菌的数量会对检测结果影响很大，会产生假阴性或假阳性结 果，同时其检测时间也较长，好事费力。因此，开发廉价、敏感度高、能快 速检测牛奶等液体样品，且非专业人员可操作，结果可信的微生物法残留检
测筛选方法成为急需解决的问题。 发明内容本发明的目的在于克服现有技术在推广使用过程中存在的上述缺陷，提 供一种不需要特定大型分析仪器设备，具有灵敏度高、可信度高、使用方法 简单的筛选方法，使其能有效降低牛奶等液体样品中抗菌药物残留的检测成 本，减轻需检测单位的负担，适于基层推广。本发明的目的通过以下技术方案实现一种快速筛选牛奶类液体样中抗菌药物残留的方法，特点是它包括制 备检测用液体培养基、制备含有细菌芽孢和酸碱指示剂的琼脂培养基检测管 及筛选，其具体步骤如下(1) 、制备检测用液体培养基取0.6% 1.5%蛋白胨、0. 4% 1.0%胰蛋白胨、0. 15% 0. 4%牛肉浸膏、 0. 4% 0. 8%葡萄糖、0% 1.0%酵母浸高、1.0% 2. 0%氯化钠、1.0% 2. 0%牛 奶粉，加去离子水补足总体积为100%，混匀后每lOOOmL前述溶液再添加含 0. 5。/。氯化钙、0.25%氯化钠、0. 25%氯化钾的无机盐溶液20 40mL， 6 p g/mL 的甲氧苄氨嘧啶溶液30 60mL，混匀后调pH为6.8 7.6，在115'C灭菌30 分钟，冷却后在0 4"C保存备用。(2) 、制备含有细菌芽孢和酸碱指示剂的琼脂培养基检测管 a、制作芽孢率达85%以上的芽孢菌液芽孢杆菌在含有1%胰蛋白胨、0.5%酵母浸膏、0.2% K2HP04， pH 7.2的液 体培养基中55。C培养18 20h，然后转种于含O. 2 0. 3%牛肉浸膏、0. 4 0. 5% 蛋白胨、0. 3 0. 4%酵母浸膏、50 200mg/L的MnCl2. 4H20、 2%琼脂，pH7. 2的 固体培养基50 60'C培养3 7天；芽孢染色镜检，当芽孢率在85%以上时，用 4r无菌去离子水洗下并置于9(TC水浴锅中加热灭活20分钟；5000rpm离心20 分钟，弃去上清液，灭菌去离子水重新漂浮，重复离心洗漆两次。最后的沉 降物用4'C无菌去离子水漂浮，细菌计数后得芽孢菌液。b、 酸碱指示剂与琼脂混合，加入去离子水，使酸碱指示剂和琼脂浓度分 别达到50 100ug/mL和1.5 2。/。，混匀调pH7. 0 7. 2，并115'C灭菌30分钟。c、 灭菌完毕后使琼脂冷却至55 75。C时，迅速加入已计数的芽孢菌液， 使芽孢含量达1X106 cfu/mL lX108cfu/mL，立即充分混匀并分装于竖直状 态的无菌管中；每支管加入50 400uL琼脂，使管内琼脂厚度达O. 2 0. 6厘米，竖直状态自然凝固后密封并于o 4t:冷藏备用。(3)、筛选用移液管I将50 200uL牛奶类液体样加入到含有细菌芽孢和酸碱指 示剂的琼脂培养基检测管，再用移液管II向琼脂培养基检测管加入50 200 uL检测用液体培养基，将琼脂培养基检测管竖直置于55"C 7(TC培养 1. 5 4小时后，根据琼脂培养基检测管内固体琼脂培养基颜色变化的性质及 程度筛选出含有抗菌药物残留的样品。所述芽孢菌液为嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌芽孢菌液。 所述酸碱指示剂为溴甲酚紫、溴甲酚蓝或溴甲酚红指示剂。所述无菌管是内径为0. 3 1. 5厘米、高度为1. 0 3. 0厘米的透明圆柱 形聚苯乙烯塑料管或容积为0. 5 1. OmL透明带盖尖底离心管。本发明的检测原理为在没有抗菌药物等抑制细菌芽孢生长的物质存在 时，芽孢在充足的营养，适当的温度、湿度等条件下能迅速生长繁殖，进而
使培养基变成酸性，这一现象可用酸碱指示剂显色指示(呈黄色)；当牛奶等液体样品中残留有抗菌药物时，芽孢的生长和繁殖受到抑制，芽孢虽然在充 足的营养，适当的温度、湿度等条件下却不能迅速生长繁殖，进而培养基也 不会变成酸性，酸碱指示剂也不会改变颜色(呈紫色)，因而可检测牛奶等液 体样品中是否有抗菌药物，并且培养后指示剂的颜色变化的深度与抗菌药物 的浓度呈一定的反向相关性，紫色越深，抗菌药物残留浓度越高。本发明对纯牛奶中青霉素残留的灵敏度在2 3ng/mL之间，耗时在3小时以内。本发明具有以下特点1、主要试剂均以工作液形式提供，检验方法方 便易行；2、对辅助设备要求低，特别适合于奶站等基层使用；3、对抗菌药 物检测谱广，特异性高、灵敏度高、准确度好，检测纯牛奶中青霉素残留的 灵敏度在2 3ng/mL之间，低于国家最高残留限量标准，符合残留检测要求； 4、样品几乎不需要前处理，肌肉、肝脏等组织可通过压榨等方式取组织液检 测；5、能在2 4小时内完成检测，快速、省时；6、阳性样品测试结果可在 55。C 7(TC保存1.5 3小时或更长，在4。C保存30天以上。将为牛奶等液 体样品中抗菌药物残留的监控提供有力保障。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。 实施例l牛奶样的筛选(1)、制备检测用液体培养基取1.0%蛋白胨、0.7%胰蛋白胨、0.2%牛肉浸膏、0. 7%葡萄糖、1.5%氯化 钠、1.5%牛奶粉，加去离子水补足总体积为100mL，混匀后再添加含0.5%氯 化钙、0. 25%氯化钠、0. 25%氯化钾的无机盐溶液2. 5mL， 6 u g/mL的甲氧苄氨 嘧啶溶液4mL，混匀后调pH为7.2，在115。C灭菌30分钟，冷却后在0 4°C 保存备用。(2) 、制备含有细菌芽孢和酸碱指示剂的琼脂培养基检测管a、 制作芽孢率达85%以上的芽孢菌液将嗜热芽孢杆菌在含有1%胰蛋白胨、0. 5%酵母浸膏、0. 2% K2HP04， pH 7. 2 的液体培养基中55'C培养18h，然后转种于含0.3%牛肉浸膏、0.5%蛋白胨、 0. 4%酵母浸膏、200mg/L的MnCl2. 4H20、 2%琼脂，pH7. 2的固体培养基55。C培 养5天。芽孢染色镜检，当芽孢率在85%以上时，用4。C无菌去离子水洗下并 置于90'C水浴锅中加热灭活20分钟。5000rpm离心20分钟，弃去上清液， 灭菌去离子水重新漂浮，重复离心洗涤两次。最后的沉降物用4'C无菌去离 子水漂浮，细菌计数后得到嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢菌液。b、 将溴甲酚紫与琼脂混合，加入去离子水100mL，使溴甲酚紫和琼脂浓 度分别达到80 u g/mL和1. 5%，混匀调pH7. 0，并115。C灭菌30分钟。c、 灭菌完毕后使琼脂冷却至65'C时加入己计数的芽孢液，使芽孢含量 达lX107cfu/mL左右，立即充分混匀并分装于竖直的内径为0.8厘米、高为 1.5厘米的透明圆柱形聚苯乙烯塑料管。每支管加入150uL琼脂，使管内琼 脂厚度达0.3厘米，自然凝固，密封并于0 4'C冷藏备用。(3) 、牛奶样品的筛选筛选前所有试剂应保存在(TC 4nC，使用时应让其自然回温到室温，使 用完毕后应及时保存在0'C 4'C。同时，筛选用的恒温装置应提前设定并到达64土rc。第1步将水浴锅或其它恒温装置如沙浴锅设定为64士rC; 第2步取一支检测管，将牛奶样品摇匀，用移液管I吸取牛奶至指定 刻度(100iiL)加入检测管中； 第3步将检测用液体培养基摇匀，用移液管II吸取检测用液体培养基 至指定刻度(50liL)，加入检测管中；第4步另取两支检测管，分别按第2、 3步重复加样(一般一个牛奶 样品使用三支检测管)；第5步立即将检测管竖直放入64士rc水浴锅(注意不能让检测管倾覆)培养并开始计时；第6步培养2.5小时后立即取出检测管，并与比色卡片对照。若三支 检测管内培养基颜色全部变为黄色可判定为阴性；若三支检测管内培养基颜 色全部变为全部紫色判定为阳性；若其中两支检测管内培养基颜色全部变为 黄色可判定为阴性；若其中两支检测管内培养基颜色全部变为紫色可判定为 阳性。第7步纪录结果并妥善处理检测管在筛选中也可将去离子水代替牛奶作为阴性对照，将含有4ng/mL的青 霉素溶液作为阳性对照。 实施例2其它样品的筛选肉、肝脏、肾脏等组织可经过称量后压榨取汁并加适量磷酸盐缓冲液调 pH至7.0;饲料，血清、蜂蜜、尿等样品如果必要的话，对不同的动物样品， 加入不同的缓冲液，以控制pH。其它操作步骤同实施例l。
权利要求
1、一种快速筛选牛奶类液体样中抗菌药物残留的方法，其特征在于它包括制备检测用液体培养基、制备含有细菌芽孢和酸碱指示剂的琼脂培养基检测管及筛选，其具体步骤如下(1)、制备检测用液体培养基取0.6％～1.5％蛋白胨、0.4％～1.0％胰蛋白胨、0.15％～0.4％牛肉浸膏、0.4％～0.8％葡萄糖、0％～1.0％酵母浸膏、1.0％～2.0％氯化钠、1.0％～2.0％牛奶粉，加入去离子水，补足总体积为100％；混匀后每1000mL前述溶液再添加含0.5％氯化钙、0.25％氯化钠、0.25％氯化钾的无机盐溶液20～40mL，6μg/mL的甲氧苄氨嘧啶溶液30～60mL；再次混匀后调pH为6.8～7.6，在115℃灭菌30分钟，冷却后在0～4℃保存备用；(2)、制备含有细菌芽孢和酸碱指示剂的琼脂培养基检测管a、制作芽孢率达85％以上的芽孢菌液；b、将酸碱指示剂与琼脂混合，加入去离子水，使酸碱指示剂和琼脂浓度分别达到50～100μg/mL和1.5～2％，混匀调pH7.0～7.2，并115℃灭菌30分钟；c、灭菌完毕后，在b步骤仍处在融化状态时使其冷却至55～75℃，并迅速加入步骤a的芽孢菌液，充分混匀后立即分装于处于竖直状态的无菌管中，每支管加入50～400μL琼脂，使管内琼脂厚度达0.2～0.6厘米，竖直状态自然凝固后密封并于0～4℃冷藏备用；(3)、筛选用移液管I将50～200μL牛奶类液体样加入到含有细菌芽孢和酸碱指示剂的琼脂培养基检测管，再用移液管II向琼脂培养基检测管加入50～200μL检测用液体培养基，将琼脂培养基检测管竖直置于55℃～70℃培养1.5～4小时后，根据琼脂培养基检测管内固体琼脂培养基颜色变化的性质及程度筛选出含有抗菌药物残留的样品。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述芽孢菌液为嗜热脂肪芽 孢杆菌或枯草芽孢杆菌芽孢菌液。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述酸碱指示剂为溴甲酚紫、 溴甲酚蓝或溴甲酚红指示剂。
4、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述无菌管是内径为0.3 1. 5厘米、高度为1. 0 3. O厘米的透明圆柱形聚苯乙烯塑料管或容积为0. 5 l.OmL透明带盖尖底离心管。
5、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述芽孢菌液浓度为1 X 106 cfu/mL lX108cfu/mL。
全文摘要
本发明公开了一种快速筛选牛奶类液体样中抗菌药物残留的方法，它包括制备检测用芽孢菌液，制备含有工作菌和指示剂的琼脂培养基检测管，制备检测用液体培养基；利用抗菌药物能抑制对它敏感的细菌生长或繁殖的原理，用定量移液管吸取被检液体样滴加入琼脂培养基检测管中并加入检测用液体培养基，在一定温度条件下处于竖直状态培养一定时间，根据检测管内固体琼脂培养基颜色的变化的性质和程度判断样品中是否含有抗菌药物残留。与现有技术比较，本发明具有检测方法快捷简便、干扰小、检测谱广、灵敏度高、准确度高、稳定性好等特点，适用于牛奶类液体样农产品中抗菌药物残留的高通量快速筛选检测。
文档编号C12Q1/18GK101131362SQ20071004660
公开日2008年2月27日 申请日期2007年9月29日 优先权日2007年9月29日
发明者张丽芳, 张可煜, 王霄旸, 薛飞群, 裘敏琪, 费陈忠, 郑文丽 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所