一种真菌油脂提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种真菌油脂提取方法，其通过酶-超声波联用的方法酶解真菌细胞壁（即利用超声波辅助几丁质酶和蜗牛酶酶解真菌细胞壁），再加入SDS将真菌细胞进一步裂解，加入异丙醇和正戊烷进行一次或多次油脂提取。本方法工艺简单，真菌细胞破壁完全，油脂提取率高，达到95%以上。本方法所用的主要提取溶剂正戊烷沸点和气化潜热均较低，毒性低，相对于现有的真菌油脂提取方法，耗能低，环境安全性高。
【专利说明】一种真菌油脂提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域，具体涉及一种真菌油脂的提取方法。
【背景技术】
[0002]随着化石燃料的日益减少，能源问题引起了全球的广泛关注，寻找新型可再生能源已经成为必经之路。真菌产油以其生产周期短，油脂含量高，可以利用多种废弃物发酵产油，不与人类争粮，生产成本低，安全环保等优势特点，具有广泛的开发应用潜力。
[0003]产油真菌一般将油脂贮藏在胞内，因此，在油脂提取过程中，必须先将真菌细胞进行破壁处理，将油脂释放到胞外，才可以用溶剂进行油脂提取，因此真菌细胞的破壁程度，对真菌油脂的提取率有很大的影响。真菌的破壁方法较多:液氮研磨，反复冻融，超声波，酸热法，菌体自溶和酶解法等。单一的使用某种破壁方法，其破壁效果一般不好，因此，需将几种破壁方法联合使用，以提高破壁效果。
[0004]目前微生物油脂的提取方法已申请相关专利，比如:201010593183.4号发明专利公开了一种微生物油脂的提取方法，以产油微生物发酵醪液为原料，经过酶解、有机溶剂浸提得到微生物油脂。该方法通过直接在发酵液中添加酶进行细胞破壁，酶的用量较大，成本较高；且单一的酶解破壁，不与其他方法联用，其细胞破壁率较低，且耗时较长。且其所用萃取溶剂的沸点和气化潜热均较高，因此，在油脂提取和有机溶剂回收过程中所需温度相对较高，能耗较大。201210511744.0号发明专利公开了一种微藻油脂的提取方法，通过在超声波场条件下用反复冻融的方法破碎细胞壁，然后利用特定比例的有机溶剂混合物萃取油月旨。该方法通过在超声波场中反复冻融的方法进行细胞破壁，细胞破壁耗时较长，而且破壁率不高，这将影响后续的油脂提取效率。
【发明内容】
[0005]针对上述现有的技术问题，本发明提供了一种工艺简单、能耗低、效率高的真菌油脂提取方法。
[0006]为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下:
一种真菌油脂提取方法:其特征在于，所述方法包括下列步骤:
(1)菌体培养；
(2)菌体收集:通过离心机对真菌培养液进行离心,收集真菌湿菌体；
(3 )菌体细胞壁酶解:将收集到的湿菌体溶解于酶解缓冲液中，加入几丁质酶和蜗牛酶将细胞壁酶解，同时加超声波辅助酶解，形成菌体酶解液；
(4)菌体细胞裂解:向菌体酶解液中加入SDS溶液进一步裂解细胞，获得菌体细胞裂解
液；
(5)有机溶剂提取:向菌体细胞裂解液中加入异丙醇提取一段时间后，再加入正戊烷进行一次或多次提取，每次加入正戊烷提取后离心收集上层正戊烷层，整个提取过程中加超声波辅助提取；(6)回收有机溶剂:合并有机溶剂提取后所得的正戊烷层，回收有机提取剂，得到真菌油脂。
[0007]进一步，所述步骤(2)中离心机的离心速率为200(T6500rpm，离心时间为5~40mino
[0008]进一步，所述步骤(3)中的酶解缓冲液为:山梨酸0.5^2mmol/L,CaC12 5^20mmol/L, EDTA 0.05~0.2mmol/L,ρΗ5.0~8.0。
[0009]进一步，所述步骤(3)中酶解缓冲液的加入量为2~20mL/g湿菌体。
[0010]进一步，所述步骤(3)中几丁质酶的加入量为5(T800U/g湿菌体，蜗牛酶的加入量为10(Tl500U/g湿菌体，酶解温度为2(T70°C，酶解时间为15~60min ;辅助酶解的超声波功率为10(T300W，频率为25~40kHz。
[0011]进一步，所述步骤(4)中SDS溶液浓度为0.1-0.25mol/L，加入量为2~20mL/g湿菌体，反应温度为3(T70°C，反应时间为2~lOmin。
[0012]进一步，所述步骤(5)中异丙醇的加入量为5~20mL/g湿菌体，异丙醇的提取温度为15~60°C，提取时间为0.5~4min。
[0013]进一步，所述步骤(5)中正戊烷提取次数为I飞次，正戊烷的初次加入量为8~30mL/g湿菌体，正戊烷用量以初次加入量为准依次减少f3mL/g湿菌体；提取温度为15~35°C，每次提取时间为I~lOmin。
[0014]进一步，所 述步骤(5)中辅助提取超声波功率为20(T600W，频率为3(T60kHz。
[0015]本发明的有益效果:
油脂提取率高:本发明在真菌破壁预处理过程中，采用酶-超声波联用的方法，提高了酶的活性，从而增加了真菌细胞的破壁效率；再加入SDS溶液裂解细胞，进一步增加了真菌细胞的破碎程度，从而使得真菌的油脂提取率达到95%以上。
[0016]节能环保:本方法所用的主要萃取溶剂正戊烷沸点和气化潜热均较低，毒性低，相对于现有的真菌油脂提取方法，耗能低，环境安全性高。
[0017]操作简单:不需要特殊的仪器设备，样品处理量大，适合大规模的工业化生产使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为本发明一种真菌油脂提取方法的流程图。
[0019]具体实施方法
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
[0020]菌体的实际油脂含量的测定方法参照油脂提取的经典方法(Bligh E.G.，Dyerff.J.A rapid method of total lipid extraction and purification.CanadianJournal of Biochemistry and Physiology, 1959, 37 (8): 911-917),该方法普遍用于真菌油脂的提取，结果准确，与样品的实际含油量十分接近。因此，将该方法的油脂提取率设定为100%，计算其他方法的油脂提取率。
[0021]实施例1
参考文献(李永红等，广谱碳源产油酵母菌的筛选.中国生物工程杂志，2005，25 (12):39-44 )所述产油酵母的培养方法，培养红冬抱酵母Rhodosporidium toruloides (中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号AS2.1389),4000rpm/min离心15min,收集湿菌体,经典方法测得干燥菌体的油脂含量为52.6%。
[0022]参照附图1所示的一种真菌油脂提取方法，包括以下步骤:(I)菌体培养:培养红冬孢酵母(与上述参考文献中产油酵母的培养方法相同)；(2)菌体收集:通过离心机对真菌培养液进行离心，收集20g真菌湿菌体,离心速率4000rpm/min离心15min ； (3)菌体细胞壁酶解:将收集到的湿菌体溶解于酶解缓冲液中，所述酶解缓冲液为山梨酸lmmol/L，CaCl210mmol/L, EDTA 0.lmmol/L 的混合液，加入量 200ml, ρΗ6.5，加入 Ig 几丁质酶(0.8万U/g)和1.6g蜗牛酶(I万U/g)将细胞壁酶解，同时加功率为200W，频率为30kHz超声波辅助酶解，温度45°C酶解30min，形成菌体酶解液；(4)菌体细胞裂解:向菌体酶解液中加入160 mL0.2 mo I/L SDS溶液进一步裂解细胞，温度55°C裂解5min，获得菌体细胞裂解液；(5)有机溶剂提取:向所得菌体细胞裂解液中加入200mL异丙醇，充分混匀，温度45°C条件下提取lmin，重复加入正戊烷，进行3次提取，首次加入量为300mL，后2次每次依次减少40mL，充分混匀，温度33°C条件下，每次提取4min，整个提取过程中加功率为400W，频率为40kHz超声波辅助提取，每次加入正戊烷提取后，提取液在离心速率8000rpm/min的离心机中离心lOmin，收集上层正戊烷层；(6)回收有机溶剂:合并3次有机溶剂提取后所得的正戊烷层，回收有机溶剂，得到真菌油脂。
[0023]本发明方法的油脂提取率为97.3%。
[0024]实施例2
参考文献(何荣等，深黄伞形霉IsabelIina)华2_1产油发酵培养条件优化.应用与环境生物学报，2012，18 (I):80-85)所述丝状产油真菌的培养方法，培养深黄被孢霉iforii6?ri?77a IsabelIina (中国普通微生物菌种保藏管理中心,编号AS3.3410),2000rpm/min离心40min,收 集湿菌体,经典方法测得干燥菌体的油脂含量为45.4%。
[0025]与实施例1不同的是:
步骤(1)菌体培养:培养深黄被孢霉(与上述参考文献中丝状产油真菌的培养方法相
同)；
步骤(2)菌体收集:收集IOg真菌湿菌体,离心速率2000rpm/min,离心40min ；
步骤(3)菌体细胞壁酶解:山梨酸 0.5mmol/L，CaCl2 5mmol/L, EDTA 0.05mmol/L,pH7.5，加入1.5g蜗牛酶(I万U/g)，同时施加功率为150W，频率为25kHz的超声波辅助酶解，37°C 酶解 25min ；
步骤(4)菌体细胞裂解:向菌体酶解液中加入200mL0.1 mo I/L SDS，温度45°C裂解IOmin ；
步骤(5)有机溶剂提取:向所得菌体细胞裂解液中加入120mL异丙醇，温度30°C条件下提取2min，加入正戊烷提取4次，首次加入量为200mL，后3次每次依次减少30mL，温度25°C，每次提取lOmin，超声波功率为200W，频率为30kHz ；
步骤(6)回收有机溶剂:合并4次有机溶剂提取后所得的正戊烷层；
按照实施例2真菌油脂提取率为95.7%。
[0026]实施例3
参考文献(李永红等，广谱碳源产油酵母菌的筛选.中国生物工程杂志，2005，25 (12):39-44)所述产油酵母的培养方法,培养粘红酵母glut inis (中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号AS2.703),6500rpm/min离心5min，收集湿菌体，经典方法测得干燥菌体的油脂含量为50.8%。
[0027]与实施例1不同的是:
步骤(1)菌体培养:培养粘红酵母(与上述参考文献中培养产油酵母的方法相同)； 步骤(2)菌体收集:离心速率6500rpm/min,离心5min ；
步骤(3)菌体细胞壁酶解:山梨酸2mmol/L，CaC12 20mmol/L,EDTA 0.15mmol/L，取酶解缓冲溶液40mL,pH5.8，加入0.125g几丁质酶(0.8万U/g)和1.2g蜗牛酶(I万U/g),同时施加功率为300W，频率为40kHz的超声波辅助酶解，55°C酶解60min ；
步骤(4)菌体细胞裂解:向菌体酶解液中加入40 mL0.25mol/L SDS，温度60°C裂解IOmin ；
步骤(5)有机溶剂提取:向所得菌体细胞裂解液中加入160mL异丙醇，温度60°C条件下提取2min，正戊烷后2次每次依次减少20mL，35°C条件下，每次提取8min，超声波功率为600W ；
按照实施例3油脂提取率为84.7%。
[0028]实施例4
参考文献(李永红等，广谱碳源产油酵母菌的筛选.中国生物工程杂志，2005，25 (12):39-44)所述产油酵母的培养方法,培养油脂酵母starkeyi (中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号AS2.1560)，4500rpm/min离心30min，收集湿菌体，经典方法测得干燥菌体的油脂含量为47.8%。
[0029]与实施例1不同的是:
步骤(1)菌体培养:培养油脂酵母(与上述参考文献中培养产油酵母的方法相同)； 步骤(2)菌体收集:收集IOg真菌湿菌体，离心速率4500rpm/min,离心30min ；
步骤(3)菌体细胞壁酶解:山梨酸1.5mmol/L,CaC12 15mmol/L,EDTA 0.2mmol/L，取酶解缓冲溶液150mL, ρΗ8.0，加入0.75g几丁质酶(0.8万U/g)和0.1g蜗牛酶(I万U/g),同时施加功率为IOOW的超声波辅助酶解，50°C酶解45min ；
步骤(4)菌体细胞裂解:向菌体酶解液中加入150 mL0.2mol/L SDS，50°C裂解8min ；步骤(5)有机溶剂提取:向所得菌体细胞裂解液中加入50mL异丙醇，温度15°C条件下提取2min,正戍烧首次加入量为80mL,后2次每次依次减少IOmL, 15°C条件下，每次提取lOmin，超声波功率为500W，频率为60kHz ；
按照实施例4油脂提取率为78.4%。
[0030]实施例5
与实施例1不同的是:
步骤(2)菌体收集:收集IOg真菌湿菌体，离心速率3000rpm/min离心20min ；
步骤(3)菌体细胞壁酶解:EDTA 0.12mmol/L,取酶解缓冲溶液80ml，pH7.2，加入0.3758几丁质酶(0.8万~8)和0.2g蜗牛酶(I万U/g)，同时施加功率为250W，频率为40kHz的超声波辅助酶解，70°C酶解15min ；
步骤(4)菌体细胞裂解:向菌体酶解液中加入100 mL0.15mol/L SDS，温度50°C裂解8min ；
步骤(5)有机溶剂提取:向所得菌体细胞裂解液中加入150mL异丙醇，温度50°C条件下提取1.5min,加入正戊烷提取5次，首次加入量为200mL，后4次每次依次减少20mL，每次提取5min，超声波功率为300W，频率为50kHz ；
步骤(6)回收有机溶剂:合并5次有机溶剂提取后所得的正戊烷层；
按照实施例5油脂提取率为96.2%。
[0031]实施例6
参考文献(李永红等，广谱碳源产油酵母菌的筛选.中国生物工程杂志，2005，25 (12):39-44)所述产油酵母的培养方法,培养皮状丝孢酵母cutaneum (中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号AS2.571),5000rpm/min离心lOmin，收集湿菌体，经典方法测得干燥菌体的油脂含量为51.3%。
[0032]与实施例1不同的是:
步骤(1)菌体培养:培养皮状丝孢酵母(与上述参考文献中培养产油酵母的方法相同)； 步骤(2)菌体收集:收集IOg真菌湿菌体，离心速率5000rpm/min,离心IOmin ；
步骤(3)菌体细胞壁酶解:山梨酸 1.2mmol/L，CaCl2 8mmol/L, EDTA 0.08mmol/L,PH5.0，加入酶解缓冲溶液50mL，加入0.125g几丁质酶(0.8万U/g)和Ig蜗牛酶(I万U/g)，同时施加功率为300W，频率为35kHz的超声波辅助酶解，20°C酶解60min ；
步骤(4)菌体细胞裂解:向菌体酶解液中加入50 mL0.25mol/L SDS，温度70°C裂解2min ； 步骤(5)有机溶剂提取:异丙醇在40°C条件下提取0.5min，加入正戊烷提取I次，加入量为300mL，28°C条件下，提取lOmin，超声波频率为50kHz ；
步骤(6)回收有机溶剂:收集I次有机溶剂提取后所得的正戊烷层；
按照实施例6油脂提取率为81.3%。
[0033]实施例7
与实施例4不同的是:
步骤(2)菌体收集:收集20g真菌湿菌体,离心速率4000rpm/min ；
步骤(3)菌体细胞壁酶解:CaC12 12mmol/L, EDTA 0.18mmol/L,取酶解缓冲溶液120mL，ρΗ6.8，加入1.0g几丁质酶(0.8万U/g)和2.0g蜗牛酶(I万U/g),同时施加功率为200W的超声波辅助酶解，60°C酶解40min ；
步骤(4)菌体细胞裂解:向菌体酶解液中加入120mL0.15mol/L SDS，30°C裂解IOmin ；步骤(5)有机溶剂提取:向所得菌体细胞裂解液中加入200mL异丙醇，温度55°C条件下提取1.5min,加入正戊烷提取6次，首次加入量为200mL，后5次每次依次减少20mL，30°C条件下，每次提取lmin，超声波功率为450W，频率为40kHz ；
步骤(6)回收有机溶剂:合并6次有机溶剂提取后所得的正戊烷层；
按照实施例4油脂提取率为96.9%。
[0034]以上所述仅为本发明的几个优选方案，并非作为对本发明的限定，凡是利用本发明的说明书及附图内容所作的各种等效变换均在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种真菌油脂提取方法:其特征在于，所述方法包括下列步骤: (1)菌体培养； (2)菌体收集:通过离心机对真菌培养液进行离心,收集真菌湿菌体； (3 )菌体细胞壁酶解:将收集到的湿菌体溶解于酶解缓冲液中，加入几丁质酶和蜗牛酶将细胞壁酶解，同时加超声波辅助酶解，形成菌体酶解液； (4)菌体细胞裂解:向菌体酶解液中加入SDS溶液进一步裂解细胞，获得菌体细胞裂解液； (5)有机溶剂提取:向菌体细胞裂解液中加入异丙醇提取一段时间后，再加入正戊烷进行一次或多次提取，每次加入正戊烷提取后离心收集上层正戊烷层，整个提取过程中加超声波辅助提取； (6)回收有机溶剂:合并有机溶剂提取后所得的正戊烷层，回收有机溶剂，得到真菌油脂。
2.根据权利要求1所述的真菌油脂提取方法，其特征在于:所述步骤(2)中离心机的离心速率为200(T6500rpm，离心时间为5~40min。
3.根据权利要求1所述的真菌油脂提取方法，其特征在于:所述步骤(3)中的酶解缓冲液为:山梨酸 0.5~2mmol/L，CaCl2 5~20mmol/L，EDTA 0.05~0.2mmol/L, ρΗ5.0~8.0。
4.根根据权利要求3所述的真菌油脂提取方法，其特征在于:所述步骤(3)中酶解缓冲液的加入量为2~20mL/g湿菌体。
5.根据权利要求1所述的真菌油脂提取方法，其特征在于:所述步骤(3)中几丁质酶的加入量为5(T800U/g湿菌体，蜗牛酶的加入量为10(Tl500U/g湿菌体，酶解温度为2(T70°C，酶解时间为15~60min ;辅助酶解的超声波功率为10(T300W，频率为25~40kHz。
6.根据权利要求1所述的真菌油脂提取方法，其特征在于:所述步骤(4)中SDS溶液浓度为0.1-0.25mol/L,加入量为2~20mL/g湿菌体，反应温度为3(T70°C，反应时间为2~IOmin0
7.根据权利要求1所述的真菌油脂提取方法，其特征在于:所述步骤(5)中异丙醇的加入量为5~20mL/g湿菌体，异丙醇的提取温度为15飞(TC，提取时间为0.5~4min。
8.根据权利要求1所述的真菌油脂提取方法，其特征在于:所述步骤(5)中正戊烷提取次数为I飞次，正戊烷的初次加入量为8~30mL/g湿菌体，正戊烷用量以初次加入量为准依次减少f3mL/g湿菌体；提取温度为15~35°C，每次提取时间为f lOmin。
9.根据权利要求1所述的真菌油脂提取方法，其特征在于:所述步骤(5)中辅助提取超声波功率为20(T600W，频率为3(T60kHz。
【文档编号】C11B1/10GK103789083SQ201410051926
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月17日 优先权日:2014年2月17日
【发明者】胡燕花, 陈集双, 张本厚 申请人:南京工业大学大丰海洋产业研究院