新型假丝酵母菌rna提取试剂及其使用方法
【专利摘要】本发明提供了一种新型假丝酵母菌RNA提取试剂及其使用方法，是首个专门用于假丝酵母菌RNA提取的试剂，采用了溶壁酶为破壁试剂，并提供了整套的优化提取流程，选用溶壁酶进行假丝酵母菌破壁，并确定了最佳破壁时间和温度的组合，不仅充分实现了假丝酵母菌的完美破壁，并且可以最大限度除去蛋白质等杂质，具有RNA提取纯度高、产量高的特点可靠性高，提取的RNA可直接用于后续分子生物学实验，效果较好。
【专利说明】新型假丝酵母菌RNA提取试剂及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学分子生物学【技术领域】，特别涉及一种新型假丝酵母菌RNA提取试剂及其使用方法。
【背景技术】
[0002]假丝酵母菌(Candida Albicans)，亦称念珠菌，可侵犯皮肤、粘膜和内脏，表现为急性、亚急性或慢性炎症，大多为继发性感染。假丝酵母菌种类很多，但能对人致病的仅有几种，以白假丝酵母菌(C.albicans)即白色念珠菌最常见，致病力也最强，其次为热带假丝酵母菌(C.tropicalis)，其它还有克柔假丝酵母菌(C.krusei)、近平滑假丝酵母菌(C.parapsilokis)和伪热带假丝酵母菌(C.pseudotropicalis)等。
[0003]假丝酵母菌的主要特征是细胞呈球形、椭圆形、圆筒形、长条形，有时为不规则形；通过发芽而繁殖，可形成假丝菌，少数形成厚膜孢子及真菌丝。假丝酵母菌为酵母型真菌，芽生酵母在特定条件下转为菌丝后则致病力增强。
[0004]对假丝酵母菌RNA提取，然后进行研究，是现代医学技术中非常重要的研究方法与手段，现有技术中，对假丝酵母菌分子生物学水平的研究常常需提取其总RNA，目前常用的假丝酵母菌破壁提取方法有:-80°C研磨破壁法、液氮研磨破壁法、酸洗玻璃珠破壁法、Trizol法、改进Trizol法、超声粉碎法、热酹法及改良的热酹法、反复冻融法等，也有少部分学者使用过蜗牛酶破壁法。在这些方法中，超声波法和玻璃珠漩涡振荡会打断RNA链，形成小分子RNA，不适于后续的分子生物学试验要求。热酸性酚法耗时长，所用试剂多且实验中加入的酚类物质不易除去，最终易与RNA形成褐色复合物而导致RNA完全丧失生物学活性。而氮研磨法、反复冻融法等常用破壁方法虽然效果较好，但操作步骤繁琐，不适于大量样本RNA的提取。与本申请提案最为接近的技术方案为Trizol法，该方法对实验结果影响很大，Trizol法在提取白色念珠菌RNA之前往往无法充分破坏假丝酵母菌细胞壁，使提取出的RNA十分不纯，残存有蛋白质、无机盐离子及大量有机杂质等，需要后续大量的工作才能够进行应用，因而无法获得高质量的总RNA，浪费了大量的人力物力。
【发明内容】
[0005]针对现有技术方法对假丝酵母菌RNA提取影响很大、提取出的RNA残存有蛋白质、无机盐离子及大量有机杂质等上述缺陷和问题，本发明实施例的目的是提供一种可靠性更好的新型假丝酵母菌RNA提取试剂及其使用方法，破壁液破壁充分，对实验结果影响较小，利用离心吸附柱进行RNA的洗涤，可以有效除去蛋白质、无机盐离子及有机杂质等。
[0006]为了达到上述目的，本发明实施例提供如下技术方案:
[0007]一种新型假丝酵母菌RNA提取试剂，其特征在于，试剂由氯仿，70%乙醇，其中70%乙醇为无RNase去离子水配置 而成，山梨醇，乙二胺四乙酸二钠盐/40mL水溶液，沙堡罗培养基，β -巯基乙醇，溶壁酶，异丙醇、Trizol液、RNase-Free水构成。
[0008]作为上述技术方案的优选，本发明提供一种新型假丝酵母菌RNA提取试剂的使用方法，其步骤如下所示:
[0009]Ql:样品处理步骤:菌株准备:以无菌接种环挑取方式，将保存的纯化菌株，接种于沙堡罗培养基上，37°C过夜培养备用；
[0010]Q2:样品处理步骤:细胞悬液:将步骤Ql中得到的37°C过夜培养的相同量白假丝酵母菌菌落，溶于山梨醇、EDTA的混合液体中，使悬液细胞浓度0D600在0.6~1.0范围内；
[0011]Q3:将上述Q2步骤中得到的菌悬液置于离心管中，加入β-巯基乙醇和溶壁酶，25°C培养24小时至溶液看起来清亮；
[0012]Q4:将上述Q3步骤中得到的清亮溶液置于4°C环境中，以5000转/分钟的速率，离心5分钟，弃上清部分，得到白色细胞团，加入Trizol液，氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2分钟；
[0013]Q5:将上述Q4步骤中得到的溶液，在4°C环境中，以12，000转/分钟的速率，离心10分钟，将上层水相移到一个新的无RNase离心管中；[0014]Q6:将上述Q5步骤中得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，混匀，静置10分钟，以12，000转/分钟的速率，离心10分钟，弃上清部分；
[0015]Q7:将上述Q6步骤中得到的溶液加入到收集管的吸附柱中，以12，000转/分钟的速率，离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0016]Q8:向吸附柱中加入70%乙醇，以12，000转/分钟的速率，离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0017]Q9:重复步骤Q8，然后将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；
[0018]QlO:将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入RNase-Free /K，室温放置I分钟，以12，000转/分钟的速率，离心I分钟，以收集RNA溶液，并在_70°C环境中保存RNA，防止降解。
[0019]作为上述技术方案的优选，所述步骤Q2中的山梨醇、EDTA的混合液体具体混合比例为:7.28克山梨醇、1.48克乙二胺四乙酸二钠盐，溶于40mL水溶液。
[0020]作为上述技术方案的优选，所述步骤Q3中的加入巯基乙醇，具体为
0.1% β -巯基乙醇，即4.5 μ L β -巯基乙醇/4mlddH20。
[0021]本发明实施例提供的一种新型假丝酵母菌RNA提取试剂及其使用方法，是首个专门用于假丝酵母菌RNA提取的试剂，采用了溶壁酶为破壁试剂，并提供了整套的优化提取流程，由于假丝酵母菌细胞壁主要是由几丁质组成，壁厚且坚硬，破壁一直是假丝酵母菌总RNA提取的关键步骤，本申请选用溶壁酶进行假丝酵母菌破壁，并确定了最佳破壁时间和温度的组合，不仅充分实现了假丝酵母菌的完美破壁，并且可以最大限度除去蛋白质等杂质，具有RNA提取纯度高、产量高的特点可靠性高，提取的RNA可直接用于后续分子生物学实验，效果较好。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。[0023]图1为本发明实施例提供的一种新型假丝酵母菌RNA提取试剂及其使用方法的提取实验结果的总RNA电泳照片。
[0024]图2为本发明实施例提供的一种新型假丝酵母菌RNA提取试剂及其使用方法的经该方法提取的总RNA经qPCR扩增产物的电泳照片。
【具体实施方式】
[0025]下面将结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0026]实施例1
[0027]Ql:样品处理:
[0028]Qll::菌株准备:以无菌接种环挑取方式，将保存的纯化菌株接种于沙堡罗培养基上，取3-5个菌落，在37°C过夜培养备用；
[0029]Q12:细胞悬液准备:将步骤Qll得到的37°C过夜培养的相同量白假丝酵母菌菌落溶于7.28克山梨醇、1.48克乙二胺四乙酸二钠盐与40mL水溶液混合的溶液中，使悬液细胞浓度0D600在0.6~1.0 ;
[0030]Q2:将Ql步骤得到的上述细胞悬液置于1.5ml离心管中加入0.1%β -巯基乙醇(按照4.5μ LP -巯基乙醇/4mlddH20)和50个单位溶壁酶(E)，25°C培养24小时至溶液看起来清亮；
`[0031]Q3:将Q2步骤得到的清亮溶液置于4°C，以5000r/min速率，离心5min，弃上清部分，得到白色细胞团后，加入ImlTrizol液和200 μ L氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2分钟；
[0032]Q4:在4°C环境中，以12，OOOrpm速率进行离心10分钟，将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管中；
[0033]Q5:在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，混匀，静置10分钟，以12，OOOrpm速率进行离心10分钟，弃上清部分；
[0034]Q6:将Q5步骤所得溶液全部加入到收集管的吸附柱中，以12，OOOrpm速率进行离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0035]Q7:向Q6步骤中的吸附柱中加入200 μ I乙醇，12，OOOrpm离心20秒，倒掉收集管
中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
[0036]Q8:向Q7步骤中的吸附柱中加入200 μ I乙醇，12，OOOrpm离心20秒，倒掉收集管
中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；
[0037]Q9:将Q8步骤中的吸附柱置于一个新的无RNase离心管(Collection Tube
1.5ml)中，向吸附柱的中间部位加入30-50 μ I RNase-Free水，室温放置I分钟，12，OOOrpm离心I分钟，收集RNA溶液，于_70°C环境中保存RNA，防止降解。
[0038]如图1所示，图1为本发明实施例提供的一种新型假丝酵母菌RNA提取试剂及其使用方法的提取实验结果的总RNA电泳照片，每个条带从上往下分别是RNA的28S，18S，
5.8S，从左至右看该图，第2、4列为本发明实施例方法获得的RNA，第3列为现有技术中Trizol法获得的RNA，第1、5列为MarkerDLlOOO，可以明显看出，本发明实施例所获得的RNA质量明显远远高于现有技术的方法所获得的RNA。
[0039]如图2所示，图2为本发明实施例提供的一种新型假丝酵母菌RNA提取试剂及其使用方法的经该方法提取的总RNA经qPCR扩增产物的电泳照片，第I列为MarkerDL500，最后8列为18S的RNA条带，中间16列为获得的CDR1、CDR2条带，结果表明，本发明实施例所获得的RNA应用于其他后续研究效果十分好。
[0040]以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本【技术领域】的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保`护范围应所述以权利要求的保护范围为准。
【权利要求】
1.一种新型假丝酵母菌RNA提取试剂，其特征在于，试剂由氯仿，70%乙醇，其中70%乙醇为无RNase去离子水配置而成，山梨醇，乙二胺四乙酸二钠盐/40mL水溶液，沙堡罗培养基，β -巯基乙醇，溶壁酶，异丙醇、Trizol液、RNase-Free水构成。
2.根据权利要求1所述的一种新型假丝酵母菌RNA提取试剂的使用方法，其特征在于，其步骤如下所示: Ql:样品处理步骤:菌株准备:以无菌接种环挑取方式，将保存的纯化菌株，接种于沙堡罗培养基上，37°C过夜培养备用； Q2:样品处理步骤:细胞悬液:将步骤Ql中得到的37°C过夜培养的相同量白假丝酵母菌菌落，溶于山梨醇、EDTA的混合液体中，使悬液细胞浓度0D600在0.6~1.0范围内； Q3:将上述Q2步骤中得到的菌悬液置于离心管中，加入β -巯基乙醇和溶壁酶，25°C培养24小时至溶液看起来清亮； Q4:将上述Q3步骤中得到的清亮溶液置于4°C环境中，以5000转/分钟的速率，离心5分钟，弃上清部分，得到白色细胞团，加入Trizol液，氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2分钟； Q5:将上述Q4步骤中得到的溶液，在4°C环境中，以12，000转/分钟的速率，离心10分钟，将上层水相移到一个新的无RNase离心管中； Q6:将上述Q5步骤中得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，混匀，静置10分钟，以12，000转/分钟的速率，离心10分钟，弃上清部分； Q7:将上述Q6步骤中得到的溶液加入到收集管的吸附柱中，以12，000转/分钟的速率，离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中； Q8:向吸附柱中加入70%乙醇，以12，000转/分钟的速率，离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中； Q9:重复步骤Q8，然后将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干； QlO:将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入RNase-Free水，室温放置I分钟，以12，000转/分钟的速率，离心I分钟，以收集RNA溶液，并在_70°C环境中保存RNA,防止降解。
3.根据权利要求2所述的一种新型假丝酵母菌RNA提取试剂的使用方法，其特征在于，所述步骤Q2中的山梨醇、EDTA的混合液体具体混合比例为:7.28克山梨醇、1.48克乙二胺四乙酸二钠盐,溶于40mL水溶液。
4.根据权利要求2所述的一种新型假丝酵母菌RNA提取试剂的使用方法，其特征在于，所述步骤Q3中的加入β -巯基乙醇，具体为0.1% β -巯基乙醇，即4.5 μ L β -巯基乙醇/4mlddH20。
5.根据权利要求2所述的一种新型假丝酵母菌RNA提取试剂的使用方法，其特征在于，具体实施步骤为: Ql:样品处理: Qll::菌株准备:以无菌接种环挑取方式，将保存的纯化菌株接种于沙堡罗培养基上，取3-5个菌落，在37°C过夜培养备用； Q12:细胞悬液准备:将步骤Qll得到的37°C过夜培养的相同量白假丝酵母菌菌落溶于(p)7.28克山梨醇、1.48克乙二胺四乙酸二钠盐与40mL水溶液混合的溶液中，使悬液细胞浓度0D600 在 0.6 ~1.0 ; Q2:将Ql步骤得到的上述细胞悬液置于1.5ml离心管中加入0.1%β -巯基乙醇，即按照4.5 μ L β -巯基乙醇/4mlddH20和50个单位溶壁酶，25°C培养24小时至溶液看起来清売; Q3:将Q2步骤得到的清亮溶液置于4°C，以5000r/min速率，离心5min，弃上清部分，得到白色细胞团后，加入ImlTrizol液和200 μ L氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2分钟； Q4:在4°C环境中，以12，OOOrpm速率进行离心10分钟，将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管中； Q5:在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，混匀，静置10分钟，以12，OOOrpm速率进行离心10分钟，弃上清部分； Q6:将Q5步骤所得溶液全部加入到收集管的吸附柱中，以12，OOOrpm速率进行离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中； Q7:向Q6步骤中的吸附柱中加入200 μ I乙醇，12，OOOrpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中； Q8:向Q7步骤中的吸附柱中加入200 μ I乙醇，12，OOOrpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干； Q9:将Q8步骤中的吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入30-50 μ I RNase-Free水，室温放置I分钟，12，OOOrpm离心I分钟，收集RNA溶液，于_70°C环境中保存RNA,防止 降解。
【文档编号】C12N15/10GK103695415SQ201310740305
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】祁文瑾 申请人:祁文瑾