专利名称：：一种细菌鉴定试剂盒及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及微生物学细菌鉴定
技术领域：
，尤其涉及一种用于鉴定细菌唯一碳源利用的细菌鉴定试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：随着生物产业的兴起和发展，快速、准确鉴定微生物己成为医学临床、环境、工业和农业等多个领域的迫切需要。微生物常规的鉴定技术有形态结构和培养特性观察、生理生化试验、血清血试验、快速鉴定组合、分子生物学方法等。这些方法或者耗时，或者费用过于昂贵，或者技术掌握有一定的难度，无法满足更广范围的用户需求。近20年来，随着微电子、计算机、分子生物学等先进技术向微生物生学领域的渗透和多学科的交叉，微生物的鉴定试剂盒以其快速简便的优势引起人们的兴趣，近年来相继出现了一些商品鉴定系统。细菌能否利用某些化合物作为唯一碳源，反映该菌是否产生代谢这种含碳化合物有关的酶，因此可以作为细菌鉴定的重要特征。国际上现有Biolog和Biotype100两种类似试剂盒，Biolog试剂盒选用四唑紫作为细菌能否利用测试碳源的指示剂，Biotype100试剂盒以肉眼观察细菌生长的浊度作为判读标志。由于二者含48种相同碳源，约占测定总碳源数量的50%，不包含一些常见的碳源，两试剂盒测定的结果可比性低。不同细菌对95种不同碳源的代谢情况是不同的，即每种细菌形成各自特有的代谢指纹图谱。Biolog板利用微生物消耗碳源进行呼吸时，会将四唑紫染色剂，从无色还原成紫色，从而在微生物的鉴定试剂盒上形成该微生物特征性的反应模式或"指纹"。以上两进口试剂盒价格较贵，且由于二者含48种相同碳源，约占测定总碳源数量的50%，不包含一些常见的碳源，两试剂盒测定的结果可比性低。
发明内容本发明目的在于提供一种新的用于鉴定细菌碳源利用的试剂盒，选用合适的指示剂，和更加丰富全面的测试碳源，结果的可比性大大提高，克服了现有技术的不足。本发明的另一个目的是提供了所述试剂盒的制备方法。本发明还有一个目的是提供了所述试剂盒的使用方法以及在鉴定革兰氏阴性细菌和阳性细菌方面的应用。本发明的技术方案是提供一种细菌鉴定试剂盒，包括96孔酶标板、培养基、测试碳源和指示剂，所述指示剂为噻唑兰。所述噻唑兰的浓度为0.5%。所述的细菌鉴定试剂盒的培养基成分为A组分900mLNaNO310g，K2HPO42.0g，KH2PO41.0g，NaC10.1g,CaClO.lg，FeCl3O.Olg,MgS04.7H200.3g，MnS04.4H2058uM，H3B0382uM，ZnS04.7H203.5uM,KI6.0uM,CuS04.5H200.8uM,Na2Mo04.2H200.4uM,CoCl2.6H200.4uM，FeS04.7H2054uM，Na2-EDTA54uM;B组分下列a，b,c各2.5mLa.生物素20ug,VB1240iug，蒸馏水lOOmLb.盐酸硫胺素10mg,烟酸10mg,泛酸钙10mg，对氨基苯甲酸10mg，蒸馏水lOOmLc.叶酸2mg，O.OOlNNaOHlOOmL。A组分和B组分按照现有技术分别进行高温灭菌和滤膜灭菌后再进行混合使用。所述测试碳源包括糊精、淀粉、吐温40、吐温80、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、蔗糖、D-葡萄糖、麦芽糖、D-甘露糖、D-乳糖、D-半乳糖、山梨糖、L-果糖、D-果糖、D-蜜二糖、龙胆二糖、D-纤维二糖、D-棉子糖、L-棉子糖、D-木糖、木糖、菊糖、D-松三糖、松二糖、D-核糖、塔格糖、D-海藻糖、D-甘露醇、L-阿糖醇、D-阿糖醇、D-山梨醇、木糖醇、己六醇(山梨糖醇)、m-肌醇、氨基乙醇、赤藻糖醇、半乳糖醇、侧金盏花醇、甲酸钠、乙酸钠、丙酸钙、丙二酸钙、ct-酮戊二酸、丙酮酸钠、草酸钠、香草酸、葵二酸、羟基苯乙酸、苯甲酸钠、葡萄糖酸钠、柠檬酸钠、马尿酸钠、琥珀酸钠、脱氧胆酸钠、水杨酸钠、乳酸钠、酒石酸钾钠、衣康酸、乌头酸、L-苹果酸、Y-氨基丁酸、苦杏仁苷、肌苷、尿苷、水杨苷、甘油、尿素、羟甲基纤维素、D-葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸盐、丁二胺、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、L-谷胺酰氨、L-谷氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-甘氨酸、鸟氨酸盐酸盐、L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-脯氨酸、L-组氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-胱氨酸、L-羟脯氨酸、L-天冬氨酸、L-酪氨酸、L-甲硫氨酸、苯丙氨酸95种。本发明同时提供了所述细菌鉴定试剂盒的制备方法，在96孔酶标板的每孔中各加入含指示剂的基础培养基第一孔中加入15叱无菌水，其余的95孔中对应加入15叱0.1%的测试碳源，使其总体积为150HL;用冷冻干燥仪将培养基干燥；用真空无菌袋将其封装保存。所述细菌鉴定试剂盒可应用于鉴定革兰氏阴性细菌和阳性细菌。本发明还提供了所述细菌鉴定试剂盒的使用方法，包括以下步骤(1)、将待测菌株用相应的培养基平板活化12次；(2)、收集新生长的待测菌株，用0.9%的生理盐水离心洗涤菌体2次，无菌水稀释菌体，制成OD6oo值为1.5的菌悬液；(3)、取步骤(2)的菌悬液0.5ml，0D柳二1.5，加入无菌的15ml含半固体态的0.2%琼脂一去离子水中，摇匀混合完全；(4)、用八通道移液器取步骤(3)菌悬液150nL加入试剂盒的各孔中；(5)、将加好菌悬液的试剂盒放入2837℃恒温细菌培养箱中培养，根据通常细菌的最佳生长温度确定培养温度；(6)、培养1824小时后对试剂盒进行观察，以Al为对照孔确定细菌碳源利用情况。一些生长速度慢的细菌可根据其生长情况适当推迟观测时间。本发明的有益效果是提供了一种新的用于鉴定细菌碳源利用的试剂盒，与现有的细菌鉴定试剂盒的主要不同之处在于指示剂和测试碳源的不同，本发明用噻唑兰(MTT)作为判别细菌能否利用测试碳源的指示剂而现有技术例如Biolog则用的是四唑紫作为指示剂，通过试验证明MTT指示剂其灵敏度比Biolog的四唑紫更高。本发明的96孔细菌碳源利用快速鉴定试剂盒，除通过MTT指示剂的颜色变化，用肉眼观察结果外，也可用酶标仪在600ran波长处，快速直接测定细菌生长状况，测定方法为常规方法。本发明提高了不同鉴定试剂盒间测定数据的可比性，如Biolog、与Biotype100只有48种相同碳源；而Biobik与Biolog有60种相同碳源，Biotypel00有59种相同碳源。因此，本发明试剂盒能有效的鉴定细菌碳源利用情况，鉴定时间短，2024小时出结果，可鉴定革兰氏阴性细菌和阳性细菌，具有指示剂灵敏度高、操作简便、准确、生产成本低等优点。同时本发明使用方法也十分简单方便，推广性强。图1阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)模式菌株ATCC13047对碳源利用情况图2百脉根根瘤菌模式菌株(NZP2213)碳源利用情况具体实施例方式下面结合一些具体实施例和附图进--步详细说明本发明。本发明通过加入0.5%的噻唑兰到基础培养基中作为试剂盒的指示剂。在96孔酶标板的每孔中各加入含指示剂的基础培养基135A，除第一孔中加入无菌水，其余的95孔中对应加入15化0.1%的测试碳源，使其总体积为再用冷冻干燥仪将培养基干燥。最后用真空无菌袋将其封装保存。试剂盒碳源设置如表l。实施例1(1)、将阴沟肠杆菌模式菌株^^e^AscterW朋caeATCC13047用培养基平板活化1-2次；(2)、收集其新鲜菌体，用0.9%的生理盐水离心洗涤菌体2次，用无菌水洗涤、稀释菌体，制成OD6oo值为1.5的菌悬液；(3)、取步骤2的菌悬液0.5ml，0D60O=1.5，加入无菌的15ml含半固体态的0.2%琼脂一去离子水中，摇匀混合完全；(4)、用八通道移液器取步骤3菌悬液150uL加入试剂盒的各孔中；(5)、将加好菌悬液的试剂盒放入37"C恒温细菌培养箱中培养，视细菌的最佳生长温度确定培养温度；(6)、培养20小时后对试剂盒进行观察，以A1为对照孔确定细菌碳源利用情况。观察结果如图1所示。可见阴沟肠杆菌模式菌株^Jt^o^"erd朋caeATCC13047利用淀粉、蔗糖、D-葡萄糖、麦芽糖、D-甘露糖、山梨糖醇、侧金盏花醇、葡萄糖酸钠、L-精氨酸等45种碳源等碳源，具体是附图1中所示A811、Cl、C311、B2、B3、B57、B9、B12、D4、D5、E35、E7、Ell、F2、F3、F79、F12、Gl3、G6、G7、G12、Hl、H6、H8、HIO、H12;不能利用糊精、吐温40、吐温80、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、氨基乙醇、赤藻糖醇、半乳糖醇、甲酸钠、乙酸钠、丙酸钙、丙二酸钙、a-酮戊二酸、丙酮酸钠、草酸钠、香草酸、葵二酸、L-酪氨酸、L-甲硫氨酸、苯丙氨酸等50种碳源。实施例2同实施例1，将百脉根根瘤菌模式菌株NZP2213用LB平板活化后，收集其新鲜菌体，用无菌水洗涤，按上述步骤制成菌悬液。用移液器在试剂盒各孔中加入150ixL菌悬液。将加好菌悬液的试剂盒放入37"C恒温细菌培养箱中培养，4天后对试剂盒进行观察，以A1为对照孔确定细菌碳源利用情况。观察结果如图2所示。可见根瘤菌模式菌株NZP2213可利用糊精、吐温40、吐温80、蔗糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、L-果糖、D-果糖、D-木糖、木糖、D-核糖、D-海藻糖、D-甘露醇、L-阿糖醇、D-山梨醇、己六醇、m-肌醇等57种碳源，具体是附图2中所示的A2、A4、A5、A8、A9、All、Cl、C3、C4、C6、C7、CIO、Cll、B3、B57、B9、Bll、B12、Dl、D3、D4、D9、Dll、El、E2、E48、Ell、Fl4、F8、F9、F12、Gl7、G9、GIO、G12、Hl、H2、H6、H810、H12;不能利用淀粉、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、麦芽糖、D-乳糖、山梨糖、D-蜜二糖、龙胆二糖等38种碳源。<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</able>权利要求1、一种细菌鉴定试剂盒，包括96孔酶标板、培养基、测试碳源和指示剂，其特征在于所述指示剂为噻唑兰。2、根据权利要求1所述的细菌鉴定试剂盒，其特征在于所述噻唑兰的浓度为0.5%。3、根据权利要求1所述的细菌鉴定试剂盒，其特征在于所述培养基成分为A组分900rnLNaNO310g，K2HPO42.0g，KH2PO41.0g，NaC10.1g,CaClO.lg，FeCl3O.Olg,MgS04.7H200.3g，MnS04.4H2058jiM，H3B0382|iM，ZnS04.7H203.5iaM,KI6.0|uM，CuS04.5H200.8mM，Na2Mo04.2H200.4jaM，CoCl2.6H200.4jaM,FeS04.7H2054|aM，Na2-EDTA54jiM;B组分下列a,b,c各2.5mLa.生物素20jag,VB1240nig，蒸馏水lOOmLb.盐酸硫胺素10mg,烟酸10mg，泛酸钙10mg,对氨基苯甲酸10mg，蒸馏水lOOmLc.叶酸2mg,0.001NNaOHlOOmL。4、根据权利要求1所述的细菌鉴定试剂盒，其特征在于所述测试碳源包括糊精、淀粉、吐温40、吐温80、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、蔗糖、D-葡萄糖、麦芽糖、D-甘露糖、D-乳糖、D-半乳糖、山梨糖、L-果糖、D-果糖、D-蜜二糖、龙胆二糖、D-纤维二糖、D-棉子糖、L-棉子糖、D-木糖、木糖、菊糖、D-松三糖、松二糖、D-核糖、塔格糖、D-海藻糖、D-甘露醇、L-阿糖醇、D-阿糖醇、D-山梨醇、木糖醇、己六醇(山梨糖醇)、m-肌醇、氨基乙醇、赤藻糖醇、半乳糖醇、侧金盏花醇、甲酸钠、乙酸钠、丙酸钙、丙二酸钙、a-酮戊二酸、丙酮酸钠、草酸钠、香草酸、葵二酸、羟基苯乙酸、苯甲酸钠、葡萄糖酸钠、柠檬酸钠、马尿酸钠、琥珀酸钠、脱氧胆酸钠、水杨酸钠、乳酸钠、酒石酸钾钠、衣康酸、乌头酸、L-苹果酸、Y-氨基丁酸、苦杏仁苷、肌苷、尿苷、水杨苷、甘油、尿素、羟甲基纤维素、D-葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸盐、丁二胺、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、L-谷胺酰氨、L-谷氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-甘氨酸、鸟氨酸盐酸盐、L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-脯氨酸、L-组氨酸、L-色氨酸、L-缀氨酸、L-亮氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-胱氨酸、L-羟脯氨酸、L-天冬氨酸、L-酪氨酸、L-甲硫氨酸和苯丙氨酸。5、权利要求1所述细菌鉴定试剂盒的制备方法，其特征在于在96孔酶标板的每孔中各加入含指示剂的基础培养基135叱；第一孔中加入15化无菌水，其余的95孔中对应加入15叱0.1%的测试碳源，使其总体积为用冷冻干燥仪将培养基干燥；用真空无菌袋将其封装保存。6、根据权利要求5所述细菌鉴定试剂盒的制备方法，其特征在于所述基础培养基中加入的指示剂为0.5%的噻唑兰。7、权利要求1所述细菌鉴定试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤(1)、将待测菌株用相应的培养基平板活化12次；(2)、收集新生长的待测菌株，用0.9%的生理盐水离心洗涤菌体2次，无菌水稀释菌体，制成OD6oo值为1.5的菌悬液；(3)、取步骤(2)的菌悬液0.5ml加入无菌的15ml含半固体态的0.2%琼脂一去离子水中，摇匀混合完全；(4)、用八通道移液器取步骤(3)菌悬液150uL加入试剂盒的各孔中；(5)、将加好菌悬液的试剂盒放入2837°。度温细菌培养箱中培养，根据通常细菌的最佳生长温度确定培养温度；(6)、培养1824小时后对试剂盒进行观察，以Al为对照孔确定细菌碳源利用情况'全文摘要本发明公开了一种细菌鉴定试剂盒，包括指示剂、培养基和测试碳源，选用噻唑兰作为细菌能否利用测试碳源的指示剂，是一种利用96孔酶标板，预装95种不同碳源的培养基，1孔不加碳源作对照，用于快速鉴定细菌碳源利用谱的试剂盒。本发明试剂盒包含一些检测特定的生理特性的碳源和常见碳源，选用噻唑兰作为指示剂，方便肉眼观察细菌是否生长利用该碳源，更可用酶标仪在600nm波长处，快速直接测定细菌生长状况。本发明试剂盒生产成本低，鉴定时间短，20～24小时出结果，可鉴定革兰氏阴性细菌和阳性细菌，具有指示剂灵敏度高、操作简便、准确等优点。文档编号C12Q1/04GK101200755SQ200710032119公开日2008年6月18日申请日期2007年12月5日优先权日2007年12月5日发明者武张,彭桂香,蔡锦标,谭志远申请人:华南农业大学