一种癌细胞或细菌的捕获方法及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种癌细胞或细菌的捕获方法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 在生物医学领域，癌细胞和病原细菌是两类非常重要的生物靶标。对二者的高灵 敏度分析检测对于相关疾病（癌症和病原细菌引起的感染疾病）的早期诊断来说，具有极 为重要的意义。然而，大多数情况下待测样品中癌细胞及病原细菌的浓度比较低（痕量级 别），实现对其的直接生化分析和基因分型鉴定具有较大难度。因此在癌细胞和病原细菌的 实际检测过程中，需经过一个"捕获_释放"的过程，首先对待测靶标进行有效捕获，实现对 其的分离富集，然后再将富集的靶标释放并对其进行最终的生化分析和基因分型鉴定。因 此，为实现对癌细胞和病原细菌的高灵敏度分析检测，发展一种有效的生物捕获及可控释 放通用策略至关重要。
[0003]目前，针对癌细胞和病原细菌的捕获及可控释放技术主要有DNA适配体法、温控 法和微流控法。DNA适配体法是基于DNA适配体对相应靶标高特异性的亲和能力来实现癌 细胞和病原细菌的特异捕获，并利用DNA酶裂解适配体来实现捕获靶标的可控释放。温控 法是基于热敏型聚合物在不同温度下其亲疏水性质的变化来实现癌细胞和病原细菌的温 控捕获和释放。微流控法主要依据待测靶标尺寸的大小来构建相应的微流控捕获芯片，并 通过控制微流剪切力的方向和大小来实现癌细胞和病原细菌的可控释放。
[0004] 但是，DNA适配体法、温控法和微流控法都存在着各自的缺点。DNA适配体法无 法实现可逆的靶标捕获和可控释放，只能满足单次癌细胞和病原细菌特异捕获和释放的要 求。温控法涉及复杂的温敏聚合物合成步骤，其中使用的有机分子对生物靶标的活性有一 定影响，从而降低了最终癌细胞和病原细菌的检测准确性和灵敏度。微流控法需根据不同 靶标尺寸的大小精确控制微流控捕获芯片的结构，制备过程复杂，而且基于微流剪切力的 靶标释放过程会降低癌细胞和病原细菌的活性。
[0005] 因此，进一步建立一种针对癌细胞和病原细菌的生物捕获及可控释放通用策略十 分必要。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种癌细胞或细菌的捕获方法及其 试剂盒。该方法特异性强、灵敏度高，能够简便、快速、可逆地实现癌细胞或细菌的捕获及释 放，且对癌细胞或细菌的生物活性影响较小。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种癌细胞或细菌的捕获方法，该方法将NTA功能化载体与含有靶 标结合蛋白和Ni2+的样品共同孵育；靶标结合蛋白中包括组氨酸标签和能够与癌细胞或细 菌特异性结合的蛋白或抗体。
[0009] NTA为次氮基三乙酸，组氨酸标签（His-tag)为多个成串组氨酸的肽段。研究表 明，NTA在Ni2+存在条件下会与含有组氨酸（His)的分子通过螯合作用非共价结合到一起， 且此非共价结合作用在有螯合剂（如乙二胺四乙酸?DTA))存在的情况下可被打破。本 发明利用该原理，构建了NTA功能化载体，使其在Ni2+存在的条件下，与靶标蛋白（携带有 His-tag的能够与癌细胞或细菌特异性结合的蛋白或抗体）相结合，进而实现对癌细胞或 细菌的捕获。由于靶标结合蛋白与细胞或细菌的结合为特异性结合，所以所捕获的癌细胞 或细菌皆可具有良好的纯度。经实验证实，采用本发明提供的方法对癌细胞的捕获率可达 95% ;对细菌的捕获率可达96%。当需要将癌细胞或细菌释放时，以含有金属离子螯合剂 的溶液作为释放剂，便可实现癌细胞或细菌的释放。实验表明，使用本发明提供的方法在捕 获后，对癌细胞的释放率可达87 %，对细菌的释放率可达85 %，且对癌细胞或细菌的生物 活性影响较小。
[0010] 在本发明的实施例中，因转铁蛋白（TRF)对癌细胞具有特异性结合的能力。而伴 刀豆蛋白（ConA)对细菌具有特异性结合能力。因而本发明选用了His-tag转铁蛋白作为 捕获癌细胞的革巴标结合蛋白，而选择His-tag伴刀豆蛋白作为捕获细菌的革巴标结合蛋白。
[0011] 在本发明提供的一些实施例中，His-tag-转铁蛋白的浓度为30yg/mL。
[0012] 在本发明提供的一些实施例中，His-tag-伴刀豆蛋白的浓度为30yg/mL。
[0013] 在本发明提供的一些实施例中，His-tag中组氨酸的个数为6个。
[0014] 在本发明提供的一些实施例中，采用His-tag转铁蛋白捕获宫颈癌细胞；采用 His-tag-伴刀豆蛋白捕获大肠杆菌。
[0015] 本发明对结合剂中的阴离子不做限定，在一些实施例中，Ni2+由硝酸镍或硫酸镍提 供。
[0016] 在本发明提供的一些实施例中，Ni2+的浓度为100ymol/L~200ymol/L〇
[0017] 作为优选，Ni2+的浓度为100ymol/Lo
[0018] 在本发明提供的一些实施例中，捕获过程中样品与结合剂Ni2+共同孵育的温度为 25°C~37°C，时间为 30min~120min。
[0019] 作为优选，捕获过程中样品与结合剂Ni2+共同孵育的温度为25°C，时间为60min。
[0020] 本发明提供的方法只需将癌细胞或细菌样品与NTA功能化载体、靶标结合蛋白及 Ni2+共同孵育，便可实现癌细胞或细菌的高效捕获。另外，为更好满足后续癌细胞或细菌生 化分析和基因分型鉴定的需要，将捕获有癌细胞或细菌的NTA功能化载体与金属离子螯合 剂共同孵育，还可轻松实现癌细胞或细菌的可控释放。
[0021] 为了实现癌细胞或细菌的可控释放，在本发明的实施例中，共同孵育后还包括释 放步骤，具体为捕获有癌细胞或细菌的NTA功能化载体与金属离子螯合剂孵育。
[0022] 作为优选，金属离子螯合剂的浓度为100ymol/L~200ymol/Lo
[0023] 在本发明提供的一些实施例中，金属离子螯合剂为EDTA。
[0024] 在本发明提供的一些实施例中，金属螯合剂的浓度为100ymol/L
[0025] 在本发明提供的一些实施例中，在癌细胞或细菌释放过程中，NTA功能化载体与金 属螯合剂孵育的温度为25°C~37°C，时间为10min~30min。
[0026] 作为优选，在癌细胞或细菌释放过程中，NTA功能化载体与金属螯合剂孵育的温度 为25°C，时间为20min。
[0027]在本发明的实施例中，样品为细胞悬液、血液或组织匀浆。
[0028] 在本发明提供的一些实施例中，样品中癌细胞浓度为102个/mL~10 6个/mL;
[0029] 作为优选，样品中细胞的密度为2X104个/mL。
[0030] 在本发明中，样品为菌液、血液或组织匀浆。
[0031] 在本发明提供的一些实施例中，样品中细菌的浓度为103CFU/mL~107CFU/mL。
[0032] 作为优选，菌液中细菌的密度为106CFU/mL。
[0033] 本发明中所述的NTA功能化载体可为自行制备也可参照本发明提供的方法制得。 经修饰后的载体可单次使用，也可反复使用，或可在使用前重新制备。本发明对此不做限 定，其实施皆在本发明的保护范围之内。
[0034] 在本发明中，NTA功能化载体的制备方法包括：将羟基化的载体依次与3-氨丙基 三乙氧基硅烷、N，N' -琥珀酰亚胺基碳酸酯、N-(5-氨基-1-羧基戊基）亚胺基乙酰乙酸孵 育后制得NTA功能化载体。
[0035] 在本发明提供的一些实施例中，载体为玻片或硅片。
[0036] 在本发明提供的一些实施例中，载体羟基化的方法为等离子处理。
[0037] 在本发明提供的一些实施例中，载体与3-氨丙基三乙氧基硅烷孵育的溶剂为乙 醇；其中3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积分数为4% ;孵育的温度为25°C;孵育的时间为lh。
[0038] 作为优选，载体与3-氨丙基三乙氧基硅烷孵育后以乙醇冲洗、干燥。
[0039] 在一些实施例中，载体与N，N' -琥珀酰亚胺基碳酸酯孵育的溶剂为乙腈；其中 N，N' -琥珀酰亚胺基碳酸酯的浓度为10mM;孵育的温度为25°C;孵育的时间为lOmin。
[0040] 作为优选，载体与N，N' -琥珀酰亚胺基碳酸酯孵育后分别用乙腈及水冲洗、干燥。
[0041] 在一些实施例中，载体与N-(5_氨基-1-羧