Imatinib耐药的胃肠道间质瘤细胞系及裸鼠移植瘤模型构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属肿瘤生物学领域，主要涉及一种胃肠道间质瘤耐药细胞系。
【背景技术】
[0002] 胃肠道间质瘤（gastrointestinalstromaltumor，GIST)是位于胃肠道或腹腔内 的表达KIT(⑶117)蛋白的间叶源性肿瘤，绝大多数存在KIT基因的功能获得性突变，KIT 基因突变在GIST发病过程中发挥关键的作用。Imatinib是一种口服的ATP的竞争性抑制 剂，能竞争性地结合于KIT酪氨酸激酶功能区的ATP结合位点，阻断磷酸基团从ATP上转移 到蛋白质底物（KIT，TOGFRA，ABL以及BCR-ABL融合蛋白）的酪氨酸残基，从而阻断了失控 的信号传导通路，进而阻止细胞的持续增殖，并恢复细胞的正常凋亡程序，是靶向治疗胃肠 道间质瘤的重要药物。然而一般在Imatinib平均治疗24个月后，将产生耐药，因此研究肿 瘤耐药机制以及防止或逆转肿瘤耐药的发生对于提高靶向治疗效果十分重要。
[0003] 近年来，肿瘤耐药细胞系己成为重要的工具，大量研究利用它来揭示肿瘤细胞的 耐药机制、研究肿瘤细胞的耐药性逆转、开发及评价新的抗癌方法等。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种Imatinib耐药的胃肠道间质瘤细胞系及裸鼠移植瘤模型构建 方法。
[0005] 本发明根据中性蛋白酶消化原代培养法和/或组织块培养法并作改良，从1例 Imatinib治疗失败的胃肠道间质瘤中成功培养出1株Imatinib耐药的胃肠道间质瘤细胞 系，建立了胃肠道间质瘤Imatinib耐药细胞系GIST-1210。 一种Imatinib耐药的胃肠道间质瘤细胞系，保藏名为Imatinib耐药的胃肠道间质瘤 细胞系GIST-1210,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO:C201502,保藏 日期：2015年1月22日，地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编430072。
[0006] 所述的GIST-1210的原代细胞在倒置显微镜下呈互不重叠的单层，细胞生长呈成 纤维细胞状，为长梭型；GIST-1210在Imatinib药物浓度在0. 05-3剛之间时对细胞系的 生长基本没有明显影响，3-5剛时受到轻度影响，但在>10剛的高药物浓度下部分细胞的生 长受到抑制；GIST-1210细胞系包含KIT基因exonllDelWK557-558缺失突变和exonl4 T670I继发点突变；GIST-1210耐药细胞系的移植瘤模型的组织形态学特征：发生耐药后组 织形态学和免疫表型均发生了变化，从梭形细胞型变为上皮样细胞型，同时丧失了CD117 的表达。
[0007] -种采用所述的胃肠道间质瘤细胞系的耐药GIST细胞裸鼠移植瘤模型的构建方 法，建立步骤如下： 实验动物BALB/C/nu/nu品系裸鼠，无特殊病原体级，雌雄不限，鼠龄3~4周， 体重19.0 ± 2.0g;GIST-1210细胞系接种5只裸鼠，均接种于背部皮下；其饲养和实验均 在无特殊病原体环境中进行； 耐药GIST细胞接种裸鼠：收集耐药GIST细胞系数目约1X107接种于裸鼠背部皮下，次 日记为接种第1天；每日观察荷瘤鼠饮食情况、精神状态、肿瘤大小与外观，用游标卡尺每 10天测量一次裸鼠体重（g)和肿瘤的最长纵径（a)、与最长径垂直的最长横径（b)，根据公 式V(肿瘤体积)=(1/2)Xab2计算出肿瘤体积，绘制移植瘤生长曲线；经过中位时间约21天 的生长静息期后，肿瘤生长速度逐渐加快，随着接种时间的推移，肿瘤的生长逐渐加速，月中 瘤体积逐渐增大；从接种日期起，每10天计算移植瘤的体积描绘肿瘤生长曲线，GIST-1210 细胞成瘤率60%。
[0008] 本发明建立胃肠道间质瘤Imatinib耐药细胞系，为以下相关研究提供耐药肿瘤 细胞模型：研究耐药肿瘤细胞形态学及生物学特点、研究肿瘤多药耐药机制、分析靶向治 疗药物敏感性及筛选靶向治疗药物、开发肿瘤耐药逆转药物、研发更有效的肿瘤治疗方法 等。
【附图说明】
[0009] 图1是倒置相差显微镜下Imatinib耐药的原代GIST-1210细胞观察图； 图2GIST细胞系体外Imatinib药物敏感性试验； 图3GIST-1210耐药前原发突变KIT基因exonllDelWK557 - 558; 图4GIST-1210耐药后继发突变KIT基因exonl4T670I; 图5耐药胃肠道间质瘤裸鼠移植瘤生长曲线； 图6GIST-1210移植瘤HE染色； 图7GIST-1210移植瘤CD117染色。
【具体实施方式】
[0010] 本发明的耐药细胞系建立步骤如下：1例Imatinib600mg/d治疗失败的耐药 GIST(根据GIST治疗的疗效评价Choi标准，CT提示肿瘤体积增加10%并且密度改变不符 合PR标准）实行减瘤术，切取部分新鲜无菌的胃肠道间质瘤组织行原代细胞培养，建立 了GIST-1210耐药细胞系。用光学显微镜观察细胞形态，MTT法检测细胞耐药指数，行耐药 细胞系的基因突变分析，建立耐药细胞系裸鼠移植瘤模型（成瘤情况和移植瘤生长曲线，组 织学特征，免疫组织化学检测⑶117、Desmin，移植瘤基因突变分析)。我们发现，GIST-1210 有以下特点：耐药的GIST原代细胞在倒置显微镜下呈互不重叠的单层，细胞生长呈成纤 维细胞状，为长梭型（图1);GIST-1210对Imatinib也具有较强的耐药性，在Imatinib药 物浓度在〇. 05-3剛之间时对细胞系的生长基本没有明显影响，3-5剛时受到轻度影响，但 在>10剛的高药物浓度下部分细胞的生长受到一定的抑制；GIST-1210细胞系是KIT基 因exonll第557-558密码子WK(Trp-Lys)共6个碱基缺失（DelWK557-558)和exonl4 T670I继发性点突变（图3-4)，未发现TOGFRA基因突变。耐药细胞系裸鼠移植瘤模型实验显 示：随着接种时间的推移，GIST-1210肿瘤的生长逐渐加速，肿瘤体积逐渐增大，细胞成瘤 率为：GIST-1210组60% (3/5) ;GIST-1210移植瘤形态学上主要由上皮样细胞组成（图6); GIST-1210耐药移植瘤CD117阴性表达（图7);GIST-1210移植瘤细胞KIT基因exonllDel WK557 - 558和exonl4T670I继发性点突变。未发现TOGFRA基因突变。
[0011] 目前认为继发突变均通过改变KIT/roGFRA的三维构象影响imatinib的结合而导 致继发行耐药。发生于ATP结合袋的继发突变改变了ATP结合袋结构而直接影响imatinib 的结合：位于ATP结合袋的Val645和Thr670均与imatinib形成氢键，后者还行使看门残基 的功能。在继发耐药者V645A和T670I/E中，Ala645和Iso/Ile670均不能作为锚定氢键的 供应者，并且Iso/Ile670的甲基还突入imatinib结合袋，妨碍imatinib与KIT激酶结合。 并且，imatinib耐药程度还与KIT三维构象改变的程度相关，突变受体的模型显示T670I从 根本上改变了结合袋，而V645A仅导致了局部结构的改变，体外试验发现，前者对imatinib 完全耐药，而后者还可被一定浓度的imatinib抑制。继发突变为T670I者发生完全耐药并 表现出病情进展迅速、预后极差，因此对于这种类型的继发突变应该引起高度重视。
[0012] Imatinib治疗后进展的GIST通常仍保留原来的形态学特征。但是本发明公开的 GIST发生耐药后组织形态学和免疫表型均发生了变化，从梭形细胞型变为上皮样细胞型， 同时丧失了CD117的表达。这给诊断带来了一定的困难，值得我们引起重视。
[0013] 继发突变V645A仅导致了局部结构的改变，还可被高剂量的imatinib所抑制，而 继发突变T670I者对imatinib完全耐药，病情进展迅速、预后极差。因此继发突变类型对 临床实践有较大的指导价值。
[0014] 实施例1 耐药细胞系建立步骤如下： 1例Imatinib 600mg/d治疗失败的耐药GIST(根据GIST治疗的疗效评价Choi标准，CT提示肿瘤体积增加10%并且密度改变不符合PR标准）实行减瘤术，切取部分新鲜无菌 的胃肠道间质瘤组织行原代细胞培养，部分新鲜组织标本_80°C保存备用，其余手术标本固 定、石蜡包埋后行HE和免疫组织化学检查。
[0015] (1)组织块培养法 取手术切除的新鲜胃肠道间质瘤组织，仔细剔除外周可疑污染及坏死组织后，用〇. 01mol/L的PBS液冲洗3次，再用含500l^g/ml庆大霉素、500l^g/ml链霉素、500U/ml青霉素的 无血清RPMI-1640冲洗5-6次，将组织剪成小块，均匀地铺在25cm2培养瓶中，置于37°C， 5%C02的孵箱中培养。lh后，每孔加入培养基0. 5ml，继续培养。第二天再加入培养基lml。 此后每3天换液一次。培养基为含15%FCS(胎牛血清）的RPMI-1640。
[0016] (2)消化培养法 取手术切除的新鲜胃肠道间质瘤组织，仔细剔除外周可疑污染及坏死组织后，用〇. 01mol/L的PBS液冲洗3次，再用含500l^g/ml庆大霉素、500l^g/ml链霉素、500U/ml青霉素的 无血清RPMI-1640冲洗5-6次，用眼科剪尽量剪碎组织至直径〈1mm，用无血清RPMI-1640洗 2次，加入2倍体积的lmg/ml的中性蛋白酶，37°C消化60min，收集单个及小块组织的瘤细 胞，离心洗涤2次，接种于25cm2培养瓶中，培养条件为含15%FCS的RPMI-1640。次日轻轻 吸弃上清液，换新鲜培养液，此后每隔3天换液一次。
[0017] 细胞耐药后，及时冻存该浓度耐药细胞于液氮中。冻存液由20%小牛血清、 5%DMS0、75%PMI1640培养液组成，冻存过程应逐步降温，采取4°C30分钟一-20°C1小时 --70°C过夜一液氮的顺序进行。冻存细胞的复苏按以下程序进行：在一个25cm2的细胞 培养瓶中加入至少l〇ml含15%胎牛血清的培养液；从液氮中取出装有细胞的冻存管，立即 放入37 °C水浴轻轻摇动使冻存物在1分钟内解冻，用酒精棉球擦拭冻存管外壁后拿入超净 台；将解冻后的细胞悬液移入己加了培养液的培养瓶中，稍加摇动泪匀，拧松瓶盖，平放入 二氧化碳培养箱中，在37°C、5%C02、95%湿度条件下培养，约24小时细胞贴壁后换新鲜培养 液3~5ml继续培养。
[0018] 实施例2 对建立的GIST-1210细胞系进行形态学观察、生物学特性鉴定、基因突变检测： 1.倒置相差显微镜观察活细胞形态 刚分离接种的耐药GIST-1210原代细胞大约12小时开始贴壁，48小时伸展开，72小 时完全伸展开，原代培养的细胞第5天起开始增殖，约10-12天可传代。耐药的GIST-1210 细胞在倒置显微镜下呈互不重叠的单层，细胞生长呈成纤维细胞状，为长梭型（图1)。传代 1-2代后，细胞生长加快，约5-7天传代一次。传代10-15代后原代细胞生长变慢，细胞倍增 时间延长，细胞皱缩，后出现衰老、死亡。
[0019] 2. Imatinib耐药的人胃肠道间质瘤细胞系的体外药敏验证 取对数生长期的GIST-1210细胞，常规用0. 25%胰蛋白酶消化各株细胞系，离心后弃上 清，用培养基重悬细胞后，细胞计数板计数调整细