一种检测人类C-Kit基因17号外显子突变的诊断试剂盒和方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测人类c?kit基因突变类型的试剂盒，它包括SEQ ID NO.1～4所示的引物对和SEQ ID NO.5所示的探针。本发明还公开了一种检测人类c?kit基因17号外显子突变的方法。本发明试剂盒和方法可以准确检测人类c?kit基因17号外显子的D816V、D820H、N822I和N822K突变，为GIST患者的用药提供指导，临床应用前景良好。
【专利说明】
-种检测人类C-K i t基因17号外显子突变的诊断试剂盒和 方法
技术领域
[0001] 本发明属于基因检测领域，具体设及一种检测人类C-Kit基因17号外显子突变的 诊断试剂盒和方法。
【背景技术】
[0002] 胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumors, GIST)是一类起源于胃肠道间 叶组织的肿瘤，是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤，多发于中老年患者，男女发病率无明显差 异。Mazur等在1983年提出，GIST是一类区别于平滑肌瘤和神经源性肿瘤的独立肿瘤类型， 其直接病因是癌基因获得性功能突变。
[0003] 早期治疗GIST主要依赖手术切除，但是即使肿瘤完全切除，也有很多患者死于肿 瘤的复发和转移，而传统的放疗和化疗也没有明显的疗效。祀向药物特别是酪氨酸激酶抑 制剂伊马替尼的出现使得GIST治疗发生了根本性的改变，现在对于GIST的治疗已发展为针 对不同病情，采取包括手术、辅助治疗和新辅助治疗的个性化综合治疗。目前临床上治疗 GIST的一线祀向药物是格列卫（伊马替尼，诺华制药），二线药物索坦(舒尼替尼，辉瑞制 药），每个患者年消费均为十余万人民币。
[0004] 但祀向药物的疗效与有GIST患者有无基因突变及突变位点密切相关，不同的基因 突变类型患者，辅助治疗的获益存在差异，因此祀向治疗之前需进行基因检测，W预测祀向 治疗的疗效并指导祀向药物种类和剂量的选用。其规范的用药方案已经进入《中国胃肠间 质瘤诊断治疗共识》(2013年版）。
[0005] GIST患者根据其基因突变类型，可从分子水平分为3类:C-Kit突变型（80~85%)， PDGFRa突变型（5~10%)和野生型GIST(10%)。其中，C-Kit基因位于人染色体4ql2-13,全 长5230bp，含21个外显子。C-Kit基因的突变形式多样，包括缺失突变、点突变和插入突变， 突变位点主要发生在第9号（10%)、11号(70%)、13号（1%)、17号外显子(1%)。
[0006] 研究表明，C-Kit基因突变不仅可协助明确诊断GIST,而且其突变位点与GIST祀向 药物的治疗反应、用药剂量和预后有关。其中，从伊马替尼治疗反应上看，C-Kit基因有突变 的GIST病例比C-Kit野生型病例治疗反应效果好，患者肿瘤无明显进展的生存期长;C-Kit 有突变的GIST病例中，伊马替尼的疗效由高到低依次为：11号外显子突变者、9号外显子突 变者、13号外显子突变者、17号外显子突变者;另外，在伊马替尼起始用药剂量选择上，也会 因突变位点不同而异。从酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼治疗反应上看，舒尼替尼二线治疗原 发C-Kit 9号外显子突变和野生型GIST病例的疗效优于11号外显子突变患者；治疗继发性 C-Kit的13号外显子突变患者的疗效优于继发17号突变外显子。因此，检测C-Kit基因的突 变位点，对于指导GIST患者的合理用药，W进行GIST个体化诊疗，具有重要参考价值。
[0007] 但是，目前检测人类C-Kit基因 17号外显子突变，主要是通过传统的测序方式，测 序的耗费时间长且成本高，不利用普通的临床检测。即使有少数使用巧光定量PCR法的报 道，也是仅对17号外显子的其中某一个位点进行检测，检测位点单一，无法对17号外显子进 行多个突变位点的评估，不能满足实际应用的需要。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种新的定量PCR检测人类C-Kit基因突变的试剂盒和方 法。
[0009] C-Kit基因17号外显子突变的信息如下：
[0010]
[0011]本发明提供了一种检测人类c-kit基因突变类型的试剂盒，它包括SEQ ID N0.1~ 4所示的引物对和SEQ ID NO.5所示的探针。
[0012] 其中，它还包括质控引物与质控探针:沈Q ID NO.6~8所示引物对与SEQ ID NO.9 所示的探针。
[0013] 本发明还提供了所述试剂盒在制备检测人类c-kit基因17号外显子突变的试剂中 的用途。
[0014] 其中，所述17号外显子突变为D816V、D820H、N822I或N822K突变。
[0015] 本发明还提供了沈Q ID NO. 1~4所示引物对。
[0016] 本发明还提供了SEQ ID NO.5所示的探针。
[0017] 本发明还提供了一种检测人类c-kit基因 17号外显子突变的方法，它包括如下步 骤：
[001引（1)提取样本DNA:取待检组织，提取其中的DNA;
[0019] (2)基因扩增:用上述试剂盒对待检样本中的DNA进行扩增；
[0020] (3)结果检测:对DNA扩增结果进行检测。
[0021] 其中，所述17号外显子突变为D816V、D820H、N822I或N822K突变。
[0022] 本发明设计的特定引物，可W用于检出C-Kit基因17号外显子的D816V、D820H、 N822I和N822K突变。只要本发明检测试剂盒和方法测出有突变，就可W确认C-Kit基因的17 号外显子存在D816V、D820H、N822I和N82a(四种突变类型的至少一种突变。从而可W预测 GIST患者对祀向药物的治疗反应。
[0023] 本发明提供的试剂盒可W同时准确检测待检人群是否出现C-Kit基因的17号外显 子上的4个突变位点，更能准确判断待检GIST患者的药物反应，为GIST患者的用药提供指 导，且灵敏度高，特异性好，而且检测快速、简便，成本低廉，可W大量推广使用，临床应用前 景良好。
[0024] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可W做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0025] W下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于w下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0026] 图1为突变型样本测序结果图
[0027] 图2为特异性检测结果图
[002引图3为灵敏度检测结果图：编号1-5分别为浓度为8ng/ul、4ng/ul、化g/ul、Ing/ul、 0.5ng/ul的DM扩增结果。
【具体实施方式】
[0029] 下面W实施例作进一步说明，但本发明不局限于运些实施例。
[0030] 本发明所用的实验试剂与仪器如下：
[0031] FastS^dTaq DNA Polymerase:购自Roche公司，Cat No. 12 032 937 001;
[0032] Uracil DNA Glycosylase(UNG),heat labile 200U 2u/l:购自大连Takara公司， No.2820;
[003；3] dU plus dNTP Mixture(12.5X)(dATP 2.5mM，dGTP 2.5mM，dCTP 2.5mM，dUTP 7.5mM，）：购自大连Takara公司，Cat No. 4035。
[0034] 实施例1本发明检巧UC-Kit基因17号外显子突变的试剂盒和检巧巧法
[0035] -、本发明试剂盒的组成
[0036] PCR扩增试剂（1人份）：
[0037]
[003引其中'中rimer溶液"配制如下： [0039]
[0040] c-kit基因17号外显子突变的扩增引物W及检测探针:
[0041]
[0042]外控引物及探针：
[0045] 二、采用本发明试剂盒检测C-Kit基因 17号外显子突变
[0046] 1、样本DNA提取:可W使用Qiagen公司、天根公司、Promega公司等DNA提取试剂盒 提取。
[0047] W石蜡组织样本，用Qiagen公司试剂盒为例，提取DNA。
[0048] 1)利用手术刀取出组织边界无用的石蜡；
[0049] 2)将石蜡包埋组织切成4WI1厚的薄片；
[(K)加]3)迅速用灭菌小綴子取2-6枚装入面ase/RNase Free EP管中（每张摊开面积500 (最大)mm2,即边长1.6cm的正方形大小；
[0051 ] 4)加入80化1二甲苯，振荡器上震荡10s，最大转数离屯、3分钟；
[0052] 5)加入80化1二甲苯，振荡器上震荡10s，最大转数离屯、3分钟；
[0053] 6)弃二甲苯，加入80化1无水乙醇，最大转数离屯、3分钟；
[0054] 7)弃无水乙醇，挥干样品；
[0055] 8)加入 180μ1 ALT buffer及20μ1 proteinase K，56°C -小时W上，直至清亮；
[0化6] 9)90°C -小时；
[0化7] 10)离屯、6000g Imin，取上清；（此步骤是防止沉淀物阻塞柱子）
[0化引 11)加入20化1 混匀，加入20化1乙醇，再混匀；
[0059] 12)简单离屯、清洁管壁；
[0060] 13)将全部混合液加入到DNA分离柱，关盖，离屯、6000g Imin，换新的收集管；
[0061 ] 14)加入500μ1 AWl，6000g 离屯、Imin;换收集管；
[0062] 15)加入500μ1 AW2,6000g 离屯、Imin，换收集管；
[0063] 16)全速离屯、3min，干燥柱子；
[0064] 17)换一只干净的1.5ml收集管，准备收集DNA;加入20-3化1 ATE，在室溫保持Imin W溶解DM。全速离屯、Imin收集DM。
[0(?日]2、定量PCR扩增
[0066] c-kit基因突变的扩增引物W及检测探针：
[0067] C17引物溶液(Primer溶液)配制如下，配制出引物溶液后，在定量PCR体系中加入 lul即可。
[006引
[0069]
[0070] c-kit外控引物溶液(Primer溶液)配制如下，配制出引物溶液后，在定量PCR体系 中加入lul即可。[0071]
[0072] 1)定量PCR体系配制:[0073]
[0074] 按照如下表格加样入2个PCR管：[0075]
[0076] 2)BI0-RAD CFX96机器PCR热循环程序设置：
[0077]
[007引3、结果判读：
[0079] W外控信号为标准，其信号Ct值在15-25,表明上样DNA的量在允许范围W内。所有 实验样本的外控曲线均应该升起，否则重新提取DNA检测。读取待检孔(孔号l)Ct值，Ct值为 〇(或者无扩增曲线)或者大于29判读阴性，判定为无 C17突变;Ct值小于28判读该信号孔阳 性。28~29重复实验，若仍然在28~29判读C17弱阳性突变。
[0080] 其中，阳性、弱阳性:代表样品有突变，突变类型为D816V、D820H、N822I或N822K。
[0081] W下用实验例的方式说明本发明的有益效果：
[0082] 实验例1本发明试剂盒W及方法的准确度和特异性检测
[0083] 1、待检样本
[0084] 选取已知突变类型为c-kit基因17号外显子突变（分别为D816V、D820H、N822I、 N82a(突变）的临床GIST石蜡组织样本各1例（其中，D816V突变的测序结果见图1)和已知野 生型临床GIST石蜡组织样本1例，检测人类c-kit基因突变类型。
[00化]2、检测方法
[0086]本发明方法:采用实施例1的试剂盒，按照实施例1的方法进行检测。
[0087] 样本DNA提取方法:用Qiagen公司试剂盒提取：
[008引1)利用手术刀取出组织边界无用的石蜡；
[0089] 2)将石蜡包埋组织切成4WI1厚的薄片；
[0090] 3)迅速用灭菌小綴子取2-6枚装入面ase/RNase Free EP管中（每张摊开面积500 (最大)mm2,即边长1.6cm的正方形大小；
[0091] 4)加入80化1二甲苯，振荡器上震荡10s，最大转数离屯、3分钟；
[0092] 5)加入80化1二甲苯，振荡器上震荡10s，最大转数离屯、3分钟；
[0093] 6)弃二甲苯，加入80化1无水乙醇，最大转数离屯、3分钟；
[0094] 7)弃无水乙醇，挥干样品；
[0095] 8)加入 180μ1 ALT buffer及20μ1 proteinase K，56°C-小时W上，直至清亮；
[0096] 9)90°C -小时；
[0097] 10)离屯、6000g Imin，取上清；（此步骤是防止沉淀物阻塞柱子）
[009引 11)加入20化1 混匀，加入20化1乙醇，再混匀；
[0099] 12)简单离屯、清洁管壁；
[0100] 13)将全部混合液加入到DNA分离柱，关盖，离屯、6000g Imin，换新的收集管；
[0101] 14)加入500μ1 AWl，6000g 离屯、Imin;换收集管；
[0102] 15)加入500μ1 AW2,6000g 离屯、Imin，换收集管；
[0103] 16)全速离屯、3min，干燥柱子；
[0104] 17)换一只干净的1.5ml收集管，准备收集DNA;加入20-3化1 ATE，在室溫保持Imin W溶解DM。全速离屯、Imin收集DM。
[01化]3、实验结果
[0106] 如果突变型样本信号Ct值在28W内，则表示样本出现了c-kit基因17号外显子检 测突变类型(D816V、D820H、N822I和Ν823(突变）中至少一种突变。
[0107] 本发明的4例突变型样本信号Ct值均在28W内，其中D816V突变型样本的测序结果 如图2所示。图2中，曲线1是突变型样本信号；曲线2是外控信号，曲线3是阴性对照(野生型 对照）信号，样本信号Ct值在28W内，表示该样本出现了c-kit基因17号外显子的D816V突 变。
[0108] 实验结果说明，本发明方法和试剂盒的检测结果与已知检测结果比较:结果一致， 说明本发明方法和试剂盒可W准确c-kit基因17号外显子突变，准确性强；另外，阴性对照 样本Ct值大于30,为阴性，说明了本发明方法和试剂盒的特异性好。
[0109] 实验例2本发明试剂盒W及方法的灵敏度分析
[0110] 1、试验方法
[0111] 取含有人类c-kit基因17号外显子突变的DNA，定量至浓度为8ng/ul，进行等比稀 释，稀释后的浓度分别为8ng/u 1、4ng/u 1、化g/u 1、1 ng/u 1、0.5ng/u 1。
[0112] 用实施例1的试剂盒，按照实施例1的定量PCR扩增进行检测。
[0113] 2、实验结果
[0114] 如图3所示，本发明试剂盒可W检测到浓度为Ing/ul的低浓度样本，灵敏度高。
[0115] 综上，本发明提供的试剂盒可W准确检测人类C-Kit基因17号外显子突变，检测快 速、简便，成本低廉，可W大量推广使用，临床应用前景良好。
【主权项】
1. 一种检测人类c-kit基因突变类型的试剂盒，其特征在于:它包括SEQ ID N0.1~4所 示的引物对和SEQ ID NO.5所示的探针。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：它还包括质控引物与质控探针：SEQ ID NO.6~8所示引物对与SEQ ID NO.9所示的探针。3. 权利要求1或2所述的试剂盒在制备检测人类c-kit基因17号外显子突变的试剂中的 用途。4. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述17号外显子突变为D816V、D820H、 N822I 或 N822K 突变。 5.SEQ ID NO. 1~4所示引物对。 6.SEQ ID NO.5所示的探针。7. -种检测人类c-kit基因17号外显子突变的方法，其特征在于:它包括如下步骤： (1) 提取样本DNA:取待检组织，提取其中的DNA; (2) 基因扩增:用权利要求1或2所述的试剂盒对待检样本中的DNA进行扩增； (3) 结果检测:对DNA扩增结果进行检测。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述17号外显子突变为D816V、D820H、 N822I 或 N822K 突变。
【文档编号】C12N15/11GK106011254SQ201610440458
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】叶丰, 肖林, 陈卉娇
【申请人】四川大学华西医院