一种婴幼儿配方乳粉中细菌的溯源方法

一种婴幼儿配方乳粉中细菌的溯源方法
【专利摘要】本发明提供一种婴幼儿配方乳粉中细菌的溯源方法，其步骤为：对婴幼儿配方乳粉原辅料、生产环境中的细菌进行分离；对分离菌株进行DNA的提取；利用通用引物FA?27F：5'?AGTCTCTGATCATGCCTCAG?3'和RA?1492R：5'?AAGGAGGTGCTCCAGCC?3'，进行16S rDNA序列的PCR扩增，扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行检测；对步骤(3)16S rDNA序列PCR扩增产物进行测序；将获得菌株的16S rRNA基因序列利用DNAStar中的MEGA软件构建系统发育树，通过发育树分析达到对婴幼儿配方乳粉中的细菌进行溯源的目的。
【专利说明】
-种婴幼儿配方乳粉中细菌的溯源方法
技术领域
[0001] 本发明属于食品安全领域，具体设及一种婴幼儿配方乳粉中细菌的溯源方法。
【背景技术】
[0002] 婴幼儿配方乳粉作为母乳的首要替代物，是婴幼儿重要的摄食来源，为婴幼儿健 康成长和发展提供几乎全部的蛋白质、脂质、维生素、矿物质等营养物质。婴幼儿配方乳粉 要求是一个无有害菌的产品，而其生产所用的原辅料容易污染细菌，其生产过程也并不是 一个绝对无菌的环境。正是由于加工过程中运种非绝对无菌特点，导致婴幼儿配方乳粉可 能被来源于原辅料W及生产过程中的病原菌污染，进而对婴幼儿健康产生不良影响。目前 对婴幼儿配方乳粉中细菌的防控局限于对成品或原辅料、生产环境的单一检测单一防控， 不能达到从根源上追溯成品中细菌来源，针对性防控的目的。

【发明内容】

[0003] 针对上述问题，本发明提供一种婴幼儿配方乳粉中细菌的溯源方法，达到从根本 上针对性防控细菌的方法。包括W下步骤：
[0004] 1)对婴幼儿配方乳粉原辅料、生产环境中的细菌进行分离；
[0005] 2)对分离菌株进行DNA的提取；
[0006] 3)利用通用引物FA-27F : 5 ' -AGTCTCTGATCATGCCTCAG-3 ' 和RA-1492R : 5 ' - AAGGAGGTGCTCCAGCC-3 '，进行16S rDNA序列的PCR扩增，扩增产物在1 %的琼脂糖凝胶电泳 上进行检测；
[0007] 4)对步骤(3) 16S rDNA序列PCR扩增产物进行测序；
[000引5)将获得菌株的16S rRNA基因序列利用DNAStar中的MEGA软件构建系统发育树， 通过发育树分析达到对婴幼儿配方乳粉中的细菌进行溯源的目的。
[0009] 具体步骤为：
[0010] (1)对婴幼儿配方乳粉的原辅料、生产环境空气、生产环境表面进行取样；富集培 养分离细菌；
[0011] (2)按照TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒要求的具体方法对分离菌株进行DNA 的提取；
[001 ^ (3) 16S rDNA序列的PCR扩增：利用通用引物FA-27F: 5 ' -AGTCTCTGATCATGCCTCAG- 3'和RA-1492R:5'-AAGGAGGTGCTCCAGCC-3'，进行序列的扩增。PCR扩增体系为：1化L 2XTaq PCR MasterMix，上下游引物各化L，DNA模板化L，30化d地20。扩增条件：94°C预变性5min; 94°C 变性 303,58°(：退火303,72°(：延伸1.5111111，30个循环;72°(：末端延伸7111111;取扣1?0?扩增 产物在1 %的琼脂糖凝胶电泳上进行检测，电压为5V/cm，电泳液为1 X TAE，添加漠化乙锭 化B)染色后电泳30min，在凝胶成像系统下观察电泳条带情况；
[OOU] (4)将步骤(3)得到的16S rDNA序列的PCR扩增产物进行测序；
[0014] (5)将获得的16S rRNA基因序列利用DNAStar中的MEGA软件构建系统发育树，通过 发育树分析达到对婴幼儿配方乳粉中的细菌进行溯源的目的。
【附图说明】
[0015] 图1婴幼儿配方乳粉加工流程图；
[0016] 图2部分分离菌株的DNA提取电泳鉴定；
[0017] 图3部分分离菌株的PCR扩增产物电泳图：Μ:marker化2000; 1~10:分离菌株PCR 产物；
[0018] 图4肺炎克雷伯菌的16S rRNA基因序列的系统发育树：（菌株的分离来源:A26-原 料乳，A25-原料乳乳，A22-原料乳，A5-乳清粉，A1-乳清粉，A4-乳清粉，A6-矿物质，A16-营养 素，A17-营养素，A28-酪蛋白憐酸肤，A18-碳酸巧）；
[0019] 图5基于操作分类单元(97%相似水平）相对含量的12样品中细菌群落结构分布 图；
[0020] 图6冬季各样品中细菌在属水平上的分布；
[0021] 图7夏季各样品中细菌在属水平上的分布.
【具体实施方式】
[0022] W下实施例使用主要生化试剂如表1所示。
[0023] 表1本实验主要生化试剂
[0024]
[00%] 所用的主要仪器设备及软件如表2所示。
[0027]表2仪器设备和软件
[002引
[0029] 实施例1样品采集
[0030] 研究中所用的所有样品（原辅料样品、空气样品、表面涂抹样品），均由本实验室人 员分别于冬季(2014年11月）和夏季(2015年6月）采集自某婴幼儿配方乳粉加工厂。原辅料 样品信息见表3,每类样品每次采集Ξ份。
[0031 ]表3婴幼儿配方乳粉原辅料
[0032]
[0033] 空气样品和表面涂抹样品采集地区见婴幼儿配方乳粉加工流程图图1，共6个采样 地区，包括5个室内地区W及1个室外地区。其中室内地区涵盖了婴幼儿配方乳粉加工过程 的主要环节，包括前处理环节(A)、生产环节(B)、生产内包环节(C)、包装内包环节(D)、包装 环节化）；室外地区(巧作为参考地点。
[0034] 在2014年11月和2015年6月，每个月进行Ξ次样品采集，每次取样时间间隔为10 天。经过2个月6次的样品采集，收集了 14类，共84份婴幼儿配方乳粉原辅料，详细信息见表 3。针对粉状样品（α-乳白蛋白、乳清粉、酪蛋白憐酸肤、碳酸巧、营养素、乳糖、氯化钟、维生 素、核巧酸、矿物质、低聚果糖和乳铁蛋白），每类原辅料无菌采集约200g;针对液体样品（原 料乳和栋桐油），每类原辅料无菌采集约200mL。收集到的原辅料立即放在低溫采样箱中保 存。
[0035] 表面涂抹样本采集:利用被无菌憐酸盐缓冲液(PBS)润湿的无菌棉签涂抹6个不同 地区的待检区域表面(包括仪器设备、人员手、衣服、鞋底W及地面），面积大小约为30m2,采 集完毕后，放入到盛有PBS的15mL离屯、管中，4 °C保存。
[0036] 实施例2细菌的分离：
[0037] 原辅料样品
[0038] 分别称取25g婴幼儿配方乳粉原辅料样品于灭菌后的225mL ΒΡΚΞ角瓶中，充分混 合，取ImL混合液加入至Ij9血无菌PBS中，混匀后取ImL加入到另一9mL无菌PBS中，W此类推进 行梯度稀释，选择合适的稀释梯度，每个稀释梯度分别吸取1(H)化混液均匀涂布于TSA固体 培养基上，每个样品3个平行，于37Γ恒溫培养箱中培养2地，选取表观形态不同的单一菌落 于LB液体培养基中，混匀后于37Γ培养箱中培养2地。针对非单一菌落需进行纯化处理，首 先用接菌环薩取震荡后的过夜培养的LB菌液，在TSA固体培养基上进行Ξ区划线，37Γ倒置 培养2地。然后挑取单菌落，重新置于液体LB培养基中进行纯培养，连续传代2次后进行后续 试验。
[0039] 表面涂抹样品
[0040] 取出4°C下保存的表面涂抹样品，满旋混匀，经无菌PBS进行梯度稀释，选择合适的 稀释梯度，每个稀释梯度吸取10化L的稀释液均匀涂布于TSA固体培养基上，每个样品3个平 行，然后放置于37Γ恒溫培养箱中培养2地，选取表观形态不同的单一菌落于LB液体培养基 中，震荡混匀后于37Γ培养箱中过夜培养。非单一菌落的纯化方式同上，选择混浊的培养基 进行后续实验。
[0041] 收集的14类，共84份婴幼儿配方乳粉原辅料，经前期适当稀释、培养，挑取固体培 养基TSA上菌落形态不同的单一菌落后，进一步分离、纯化处理，共分离出56株，其中冬季分 离出36株，主要是原料乳中11株、乳清粉中8株、矿物质中3株、α-乳白蛋白中4株、酪蛋白憐 酸肤中2株、碳酸巧中3株、营养素中3株和核巧酸中2株;夏季分离出20株，包括原料乳中7 株、乳清粉中3株、营养素中3株、α-乳白蛋白中4株、酪蛋白憐酸肤和核巧酸中各2株。
[0042] 实施例始Β菌鉴定：
[0043] 基因组DNA提取
[0044] 对于婴幼儿配方乳粉原辅料样品W及表面涂抹样品，分别取2mL分离菌株的LB液 体菌液，按照TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒要求的具体方法对分离菌株进行DNA的提 取。
[0045] 利用细菌基因组DNA提取试剂盒对分离的细菌进行DNA提取，并在1%的琼脂糖凝 胶电泳上检测，部分结果如图2所示。
[0046] 从图中可W看到，提取的分离菌株DNA只有一条清晰的条带，没有其他杂带干扰， 说明DNA的提取结果符合要求，可W用于后续的扩增实验。
[0047] PCR扩增体系及循环条件 [004引 （1)168 rDNA序列的PCR扩增
[0049]利用通用引物FA-27F:5 '-AGTCTCTGATCATGCCTCAG-3 '和RA-1492R:5 AAGGAGGTGCTCCAGCC-3'，进行序列的扩增。PCR扩增体系为：1 化L 2XTaq PCR MasterMix， 上下游引物各化L，DNA模板化1^，30化d地20。扩增条件：94°C预变性5min;94°C变性30s，58 °C退火30s，72°C延伸1.5min，30个循环;72°C末端延伸7min(魏琳琳，胡萍，，王新华，等.婴 幼儿配方奶粉中克雷伯菌的最低检出限与回收实验研究[J].中国卫生检验杂志，2013,4: 25.)。取化LPCR扩增产物在1 %的琼脂糖凝胶电泳上进行检测，电压为5V/cm，电泳液为1 X TAE，添加漠化乙锭化B)染色后电泳30min，在凝胶成像系统下观察电泳条带情况。图3为部 分分离菌株的PCR扩增产物在1 %琼脂糖凝胶电泳上的检测结果。
[0化0] 通过与Marker条带比较，可W看到分离菌株的PCR产物条带大约为1500bp左右，且 均为单一清晰条带，引物二聚体较少，说明分离菌株的16S rRNA基因扩增比较成功，可W进 行基因测序。
[0051 ] 分离得到的56株细菌的16SrDNA序列经DNAMAN5.29软件剪切和拼接后，与BLAST 数据库中的序列进行同源性比对。关于分离菌株的16S rDNA鉴定结果及分离来源等信息如 表4和5所示。
[0052]表4冬季分离的36株细菌菌株的鉴定及分布 [0化3]
[0055]表5夏季分离的20株细菌菌株的鉴定及分布
[0化6]
[005引实施例4序列的生物学分析：
[0059] 冬季原辅料样品的细菌分布
[0060] 冬季采集的14类原辅料中，6类原辅料并未分离出细菌，运些辅料分别是乳糖、氯 化钟、维生素、低聚果糖、栋桐油、乳铁蛋白，其他8类原辅料中分离了不同数量和种类的细 菌，说明生产婴幼儿配方乳粉所使用的原辅料不全是无菌的，可能受不同厂家、不同生产环 境的影响。肺炎克雷伯菌作为主要的分离菌株，共分离到了 11株，占冬季总分离细菌的 30.6%，并且该菌分离来源比较广泛，在原料乳(3株）、乳清粉(3株）、矿物质（1株）、酪蛋白 憐酸肤(1株）、碳酸巧（1株)和营养素(2株），共6类原辅料中均分离到了该菌。其次是格氏乳 球菌，共发现了8株，占总细菌菌数的22.2%，分离自原料乳、乳清粉、乳白蛋白、碳酸巧和核 巧酸中。一些菌株分离的数量较少，且分离来源比较单一，包括芽抱杆菌属的枯草芽抱杆菌 和地衣芽抱杆菌、耶尔森氏菌的小肠结肠炎耶尔森氏菌和不动杆菌属的申氏不动杆菌，运4 类菌种均只分离出了 一株，主要来自于辅料中。
[0061] 从原料乳中分离出了6种细菌，共11株，占冬季总分离菌株的30.6%，分别是肺炎 克雷伯菌(3株）、格氏乳球菌(3株）、变栖克雷伯氏菌(2株）、乳酸乳球菌（1株）、粪肠球菌（1 株)和枯草芽抱杆菌(1株）。在乳清粉中发现了 8株细菌，包括肺炎克雷伯氏菌(3株）、变栖克 雷伯氏菌（1株）、格氏乳球菌(2株）、粪肠球菌（1株)和小肠结肠炎耶尔森氏菌（1株）。在其他 6类辅料中，分离到相对较少的细菌。运种分布表明，作为婴幼儿配方乳粉生产的主要原 料一一原料乳和乳清粉中较容易污染细菌。一些辅料(核巧酸、α-乳白蛋白、矿物质、酪蛋白 憐酸肤、碳酸巧和营养素）中发现污染细菌的几率较低。乳糖、氯化钟、维生素、低聚果糖、栋 桐油和乳铁蛋白，6类辅料中几乎没有发现细菌污染。
[0062] 冬季原辅料中肺炎克雷伯菌的基于16S rRNA基因系统发育学分析
[0063] 肺炎克雷伯菌作为主要的分离菌株，在冬季多种原辅料中均被发现，为探究不同 样品种的菌株差异，将获得的11株肺炎克雷伯菌W及3株参考菌株的16S rRNA基因序列利 用DNAStar中的MEGA软件构建系统发育树，结果如图4所示，结果表明所有分离菌株分为了 4 个类群，前7株分离株聚集程度较大;A16与A17两株菌形成一个系统发育分支;A28与参考菌 株KJ741255聚为一个类群，而A18独自一个类群，且与其他菌株相距较远。
[0064] 通过对分离菌株的来源进行探究，发现前7株分离菌株大多数分离自原料乳和乳 清粉。A25、A26和A22均分离自原料乳中形成一个系统发育分支;A5与A1分离自乳清粉中;A4 也分离自乳清粉，尽管与A5、A1在一个分支下，与分离自矿物质中的肺炎克雷伯菌A6在同一 分支中，可能是A4与A存在的乳清粉为不同批次或同一批次不同袋装的原料。分离自营养素 的菌株A16与A17聚集在一起，而与其他分离来源的菌株存在距离。此外，分别分离自酪蛋白 憐酸肤W及碳酸巧的A28和A18形成独立分支。
[0065] 夏季原辅料样品的细菌分布
[0066] 通过对夏季采集的14类原辅料，共42份样品进行细菌的分离鉴定，发现有8类辅料 并未分离出细菌，运些辅料分别是碳酸巧、乳糖、氯化钟、维生素、矿物质、低聚果糖、乳铁蛋 白W及栋桐油。其他6类原辅料中分离到不同数量和种类的细菌，再一次证明了生产婴幼儿 配方乳粉所使用的原辅料不全是无菌的。其中地衣芽胞杆菌作为主要的分离菌株，占夏季 总分离细菌的25%，在原料乳(2株）、营养素(2株)和酪蛋白憐酸肤(1株），共3类原辅料中均 分离到了该菌。一些菌株分离的数量较少，且分离来源比较单一，包括芽抱杆菌属的蜡样芽 抱杆菌、短小芽抱杆菌、索诺拉沙漠芽抱杆菌和枯草芽抱杆菌;短芽抱杆菌属的短短芽抱杆 菌W及微小杆菌属的乙酷微小杆菌，运6类菌种均只分离出了一株，主要来自于原料乳和α- 乳白蛋白中。
[0067] 作为婴幼儿配方乳粉生产的主要原料，原料乳中发现较多的细菌，经过适当梯度 稀释后，共分离出5种细菌，共7株，分别是地衣芽抱杆菌(2株）、吉氏库特氏菌(2株）、乙酷微 小杆菌（1株）、耐盐芽抱杆菌（1株)和枯草芽抱杆菌（1株），占夏季总分离细菌数的35%。部 分辅料(乳清粉、核巧酸、酪蛋白憐酸肤、α-乳白蛋白和营养素）中发现相对较少的细菌。可 见原料乳中芽抱杆菌占比例较大，运一结果与郭本恒的研究结果相符合，他指出地衣芽抱 杆菌W及枯草芽抱杆菌是原料乳中存在到的优势菌株之一，由于芽抱杆菌能够产生芽抱不 仅增强了细菌抵抗外界不良环境的能力和增强了其适应能力，同时由于芽抱的存在，可能 导致产品在后续的储存销售过程中，芽抱的大量繁殖，进而对原料乳的质量造成影响。原料 乳质量的好坏直接影响着婴幼儿配方乳粉的质量，尽管婴幼儿配方乳粉经过一些列的热加 工处理，但是并不能清除全部的细菌成为一个无菌的产品，因此为了有效价低婴幼儿配方 乳粉中细菌数量及种类，应该从源头抓起，营造良好的牛乳采集环境、选拔专业的挤乳人员 或提供先进的挤乳设施、合格的原料乳运输设备，并且制定严格的原料奶验收标准，进而有 效的降低和控制微生物数量。
[0068] 不同季节各样品的群落结构相似性分析
[0069] PCA运用方差分解，将多组数据的差异反映在二维坐标图上，坐标轴能够最大反映 方差值的两个特征值。如样本组成越相似，反映在PCA图中的距离越近。不同环境间的样本 可能表现出分散和聚集的分布情况。
[0070] 对冬夏两季12个样品中细菌的群落结构进行PCA分析，结果如图5。结果表明，12个 样品分成了两个组，冬季的6个样品聚集成组1，夏季的6个样品聚集成组2。样品的运种聚集 现象说明样品间具有相似的群落结构，进一步说明两个季节收集的各样品间的群落结构相 似度较高。相反，样品的分散现象则说明样品间存在群落结构的不同，进一步说明冬季和夏 季样品间细菌群落结构有差异，说明一些操作分类单元(0TU)并不是所有样品中都存在的。
[0071] 细菌在口水平上的分布及比较
[0072] 分离的细菌进行分子生物学分析，367株(冬季:236株，夏季：131株)细菌主要鉴定 为3个菌口，包括厚壁菌口（Firmicutes )、放线菌口（Proteobacteria)和变形菌口 (Actinobacteria)。无论是冬季样品还是夏季样品，厚壁菌口（Firmicutes)均是主要的优 势菌口，其占冬季和夏季各总分离菌株的含量分别为69.07%和51. 15%。变形菌口 (Proteobacteria)在冬季和夏季样品中的相对含量分别为27.54%和41.98%。放线菌口 (Actinobacteria)在冬季和夏季样品中含量最少，分别为3.39%和6.87%，在个别样品中 并未分离出放线菌口类的细菌，例如，冬季的前处理环节样品和生产环节样品，夏季的生产 环节样品和室外样品，一方面说明不同季节细菌群落组成存在差异，另一方面说明不同采 样环节样品中细菌群落组成也不同。各样品的结果见表6和7。
[0073] 表6不同冬季样品中细菌口水平上的分子生物学鉴定结果
[0074]
[0077] 细菌在属水平上的分布及比较
[0078] 对冬季和夏季各个样品分别在属水平上进行分类，共分离出29个不同的属(冬季 包含20个属，夏季包含21个属）。
[0079] 由图6可知，冬季表面涂抹样品共分离出了 236株细菌，包含了 20个属。其中芽抱杆 菌属(Bacillus)和肠球菌属化nterococcus)为优势菌属，含量分别为32.63%和14.41 %。 其次是肠杆菌属化nterobacter)、气球菌属（Aerococcus)、葡萄球菌属（Sta地ylococcus) 和泛菌属。日11扣6日），含量依次为6.78%、6.78%、6.36%和5.93%。此外，巧樣酸杆菌属 (Cihobacte)、片球菌属（Pediococ州S) W及节杆菌属（A;rth;robacte;r)在冬季样品中含量 较少，各仅发现了 一株且来自不同的样品点。
[0080] 不同采样点中细菌的菌属分布存在差异。6个样品点中细菌菌属的分布情况如下： 前处理环节(A)样品发现5个细菌属，生产环节(B)样品发现12个细菌属，生产内包环节(C) 样品发现15个细菌属，包装内包环节(D)样品发现15个细菌属，包装环节化)样品发现11个 细菌属W及室外样品(F)发现6个细菌属。芽抱杆菌属在所有地点中均分离得到，肠球菌属 和假单胞菌属仅分离自室内的5个样品点中。在6个采样点中，泛菌属、不动杆菌属W及微小 杆菌属均分离自处前处理环节(A)和室外样品(F)点外的其他4个样品点。而考克氏菌属和 类芽抱杆菌属分离自出生产内包环节(C)、包装内包环节(D)、包装环节化）W及室外(F)，共 4个样品点。勒克氏菌属（Leclercia)、埃希氏菌属（Escherichia)、乳球菌属 化曰(：1：0(30(3(3113)、微球菌属（1；[(31'0(30(3(3113)、克雷伯菌属化16631611日）^及拉乌尔氏菌属 (Raoultella)都有不同的分布。通过W上的结果，说明样品的菌属分布与样品点的选取有 关，菌属组成受地点的影响。不同采样点间的溫度、相对湿度W及人员流动均不同，因此对 细菌的生长及耐受均有影响。
[0081] 由图7可知，冬季表面涂抹样品共分离出了 131株细菌，包含了 21个属。其中泛菌属 (Pantoea)和芽抱杆菌属(Bacillus)为优势菌属，含量分别为22.90%和18.32%。其次是葡 萄球菌属（Sl:a曲ylococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、微小杆菌属(Microbacterium) 和气球菌属(4日'〇(3〇(3(3113)，含量依次为9.92%、8.40%、6.11%和5.34%。此外，节杆菌属 (Arthrobacter)、动性杆菌属(Planomicrobium)、短小杆菌属(Qi;rtobacte;rium)、短波单胞 菌属（Brevundimonas)、莫拉氏菌属（Moraxella)、嗜冷杆菌属（Psychrobacter)、库克氏菌 属化ocuria)和肠球菌属化nterococcus)在夏季样品中含量较少，各仅发现了一株且来自 不同的样品点。
[0082] 不同采样点中细菌的菌属分布存在差异。6个样品点中细菌菌属的分布情况如下： 前处理环节(A)样品发现7个细菌属，生产环节(B)样品发现14个细菌属，生产内包环节(C) 样品发现10个细菌属，包装内包环节(D)样品发现12个细菌属，包装环节巧)样品发现8个细 菌属W及室外样品(F)发现7个细菌属。芽抱杆菌属和气球菌属的分布比较广泛，6个采样样 品中5个采样点分离得到运两类菌。泛菌属作为主要的优势菌属，仅分离自生产环节(B)、包 装内包环节(D)和包装环节化)样品中。在6个采样点中，气球菌属分离自除前处理环节(A) 样品和室外样品(F)外的其他4个样品中。而葡萄球菌属分离自出前处理环节(A)、包装内包 环节(D)W及室外(F)，共3个样品点。此外，微小杆菌属、类芽抱杆菌属、假单胞菌属W及微 球菌属都有不同的分布。
[0083] 将两个季节各样品中细菌菌属分布进行比较，发现季节对细菌菌属种类及分布有 一定的影响，即不同季节中各样品点的细菌组分及分布不同。从菌属的分布上看，夏季收集 到相对较少的细菌，但是细菌菌属种类却比冬季菌属数多1类，可能说明夏季细菌的多样性 更高。在优势菌株的种类上，两个季节差别比较大，冬季样品的优势菌株是芽抱杆菌属、肠 球菌属、肠杆菌属、气球菌属，而夏季样品的优势菌属则为泛菌属、芽抱杆菌属、葡萄球菌 属、不动杆菌属。此外，一些菌属受季节影响较多，例如：肠杆菌属化nterobacter)、乳球菌 属化actococcus)、克雷伯菌属化lebsiella)、巧樣酸杆菌属（Citrobacter)、埃希氏菌属 化scherichia)勒克氏菌属化eclercia)片球菌属（Pediococcus)和拉乌尔氏菌属 (Raoultella)仅在冬季样品中发现。相反的，棒状杆菌属(Corynebacterium)、寡养单胞菌 属（516110化0口1101]10]1日3)、肉食杆菌属（〔日1]106日(3161'；[11111)、明串珠菌属化611(30]1031：0(3)、动性杆 菌属（Planomicrobium)、短小杆菌属（Qi;rtobacte;rium)、短波单胞菌属（Brevundimonas)、 莫拉氏菌属(Moraxella)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)仅存在于夏季样品中。通过W上的 观察，说明样品的菌属分布与样品点的选取有关，菌属组成受分离点的影响。不同采样点间 的溫度、相对湿度W及人员流动均不同，因此对细菌的生长及耐受均有影响。
[0084] 细菌在种水平上的分布及比较
[0085] 对收集到的所有菌株进行种水平上的分类，367株细菌共分离出78种细菌，其中冬 季分离出58种细菌，夏季分离出44种细菌。冬季样品中地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)、蜡样芽抱杆菌（Bacillus cereus)、浅绿气球菌（Aerococcus viridans) W及酪黄肠球菌化nterococcus casselif lavus)为主要优势菌株，含量分别为18.22%、 12.29%、6.78% W及5.08%。夏季样品中成团泛菌（Pantoea agglomerans)、酪黄肠球菌 化nterococ州S casseliflavus)、地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)和鲁氏不动杆 菌(4(3；[]161:〇6日(3161'1*(^門;〇为优势菌株，占夏季总分离菌株数的22.90%、9.16%、7.63% 和7.63%。此外，多种细菌被发现，但数量较少且大多为空气中常见的细菌，例如:芽抱杆菌 属的沙福芽抱杆菌(Bacillus safensis)和短小芽抱杆菌(Bacillus pumilus)、微小杆菌 属的乙酷微小杆菌化xiguobacterium acetylicum)、微球菌属的藤黄微球菌(Micrococcus luteus) W及棒状杆菌属的靑石南棒杆菌（Corynebacterium callunae)等等。运些细菌在 乳品加工环境中被发现，说明是乳品厂中比较常见的细菌，与生产原料或加工环境等有关。
[0086] 本发明对收集到的6个样品点的细菌群落结构和组成进行分析，样品点的分布见 图1。其中，生产内包环节(C)和包装内包环节(D)是高清洁作业区，在运里污染是必须被避 免地，因此，必须严格控制和减少微生物特别是致病菌的数量。包装环节化)收集到了相对 较多的细菌，尽管该环节并不与乳粉直接接触，但是在后续的销售、食用过程中，外包装上 的细菌也可能会污染乳粉，因此对包装环节也应进行相应的细菌总数的限定。此外，更多的 关注应该放在婴幼儿配方乳粉加工环节空气中的致病菌的分布上。报道指出：不动杆菌属 是一类医源性致病菌，当达到适当的浓度时能够引发呼吸道疾病。在本研究中，不动杆菌属 主要分离自夏季的前处理环节样品和包装环节样品。成团泛菌被证实能够引起过敏、肺部 疾病W及高度敏感牙槽炎等多种疾病，在包装内包环节样品和包装环节样品中均分离到该 菌。目前，许多研究人员将更多的目光放在了蜡样芽抱杆菌上，主要是由于蜡样芽抱杆菌不 仅能够引发食物中毒、呕吐W及其他感染疾病，而且蜡样芽抱杆菌能够产生芽抱，运些芽抱 有助于菌株抵抗外界恶劣环境，进而延长存活时间。因此对婴幼儿配方乳粉加工厂，特别是 分离出较多蜡样芽抱杆菌的包装环节中该菌的控制是必要的。本研究中分离到的一些致病 菌在其他环境中也被发现，例如:微球菌属、假单胞菌属W及库克氏菌属在医院、雾霞天W 及海洋中均有发现。Helmut等人在瑞±-家乳粉加工厂中分离到了缺陷短波单胞菌和溶酪 大球菌，然而在我们的研究中并未发现，可能是由于地域、季节W及其他一些环境参数的不 同所导致的。
[0087] 溫度、相对湿度、空气流速W及季节等环境因子可能对微生物的群落结构和分布 造成影响。本实验分别对冬季和夏季两个季节的婴幼儿配方乳粉加工环节中的细菌群落结 构和分布进行分析。可培养方法收集到的细菌结果表明，夏季样品中细菌的数量和种类高 于冬季样品的细菌数量和种类，同时高通量测序方法表明夏季样品比冬季样品具有更高的 菌属多样性。通过PCA分析发现冬季和夏季细菌群落结构和分布存在明显的不同（图5)。一 些菌属的相对峰度在不同季节差异较大。葡萄球菌属在夏季样品中有较低的百分比，小于 1.05%，然而在冬季样品中的相对峰度大于25.65%。芽抱杆菌属、Gammaproteobacteria 属、嗜冷杆菌属W及香味菌属在夏季样品中的相对含量均低于冬季样品中的相对含量。然 而，乳球菌属体现了相反的分布趋势，即冬季样品中的相对含量低于夏季样品中的相对含 量。总的来说，同冬季样品相比，夏季样品的细菌群落结构更加丰富，同时更多的细菌属在 夏季样品中被发现。
[0088] 本发明对冬季和夏季两个季节中6个采样区域的仪器、设备、人员手、衣服、鞋底W 及地面等表面进行细菌的收集。共收集到367株细菌，主要鉴定为3个菌口，包括厚壁菌口、 放线菌口和变形菌口。其中冬季样品中收集到236株，包含了20个属，共58种细菌。夏季样品 中收集到131株，包含21个属，共44中细菌。
[0089] 通过对两个季节各样品中细菌菌属分布的比较，发现尽管夏季样品分离到较少的 细菌，但是分离到的细菌菌属种类却比冬季菌属数多，可能说明夏季细菌的多样性更高，运 与空气样品结果相一致。无论是优势菌株的种类或是一些低百分含量的菌属在不同季节中 均有明显的不同。此外，通过对不同采样地点间细菌的分布情况的探究，结果表明：前处理 环节包含的婴幼儿配方乳粉加工工序较多，但分离的细菌数相对较少，可能是由于前处理 环节机械化程度比较高，大多数环节中并不需要人员，因此人员流动相对较少，加之清洁人 员的合理的有效的清扫及擦拭W及定期的CIP(Clean In Place)清洗，因此前处理环节中 细菌含量低。生产环节包括闪蒸、Ξ效蒸发、喷雾干燥、流化床和振动筛等加工工序，机械化 程度高，人员流动较少，但空间面积最大，涵盖多个楼层及房间，因此发现的菌株比前处理 环节的相对多。生产内包、加工内包W及包装发现的细菌数较多，主要在于运Ξ个环节是人 员需求量最多的环节，人员流动能够加快细菌的流动、传播、分散，同时人员在流动过程中， 自身可能携带一些细菌，导致细菌的交叉污染。室外样品中细菌的含量较少，主要在于室外 环境中空气流动快，细菌的转移频率加快，并且作为室外参考样品，仅在同一地点进行各类 样品的采集，收集时间短，因此收集细菌的随机性较高，导致分离到的细菌相对较少。
[0090] 总之，对婴幼儿配方乳粉加工厂空气中细菌群落结构和分布的分析，有利于制定 合理的措施来有效的、针对性的控制悬浮在空气中细菌，特别是一些潜在的致病菌。高效空 气过滤器的安装能够有效的较少随外部空气一同进入的细菌的数量;高频率的清洗和擦拭 仪器设备表面能够避免微生物的沉积，特别是在高风险区域更应该保持高度清洁。包装环 节人员需求量大且流动快，容易加快空气中悬浮菌的流动，易于交叉感染，因此，在包装车 间对人员进行合理的分工，有序的进行生产，较少不必要的人员流动，同时注意保持整体环 境的清洁。研究表明，工作人员的衣服和鞋子能够携带一些与污染相关的微生物，因此针对 工人必须执行严格的卫生标准来抑制微生物的生长和繁殖。此外，保持加工环节中低的空 气湿度和溫度进而减缓空气中微生物的生长。最后，婴幼儿配方乳粉厂室内外环境必须进 行常规的、定期的消毒措施，来维持一个良好的生产卫生环境，营造一个良好的婴幼儿配方 乳粉生产氛围。
【主权项】
1. 一种婴幼儿配方乳粉中细菌的溯源方法，其特征在于:步骤如下： (1) 对婴幼儿配方乳粉原辅料、生产环境中的细菌进行分离； (2) 对分离菌株进行DNA的提取； (3) 利用通用引物FA-27F: 5 '-AGTCTCTGATCATGCCTCAG-3 ' 和RA-1492R: 5 AAGGAGGTGCTCCAGCC-3 '，进行16S rDNA序列的PCR扩增，扩增产物在1 %的琼脂糖凝胶电泳 上进行检测； (4) 对步骤(3)16S rDNA序列PCR扩增产物进行测序； (5) 将获得菌株的16S rRNA基因序列利用DNAStar中的MEGA软件构建系统发育树，通过 发育树分析达到对婴幼儿配方乳粉中的细菌进行溯源的目的。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述原辅料、生产环境中的细菌来源于原 辅料、生产环境空气、生产环境表面，所述分离为富集培养分离。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:按照TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒要 求的具体方法对分离菌株进行DNA的提取。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中PCR扩增体系为：16yL 2 X Taq PCR MasterMix，上下游引物各lyL，DNA模板2yL，30yL ddH20。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(3)中PCR扩增程序:94°C预变性5min; 94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸1.5min，30个循环；72°C末端延伸7min。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(3)中电泳操作为:取5yLPCR扩增产物 在1 %的琼脂糖凝胶电泳上进行检测，电压为5V/cm，电泳液为1 X TAE，添加溴化乙锭(EB)染 色后电泳30min，在凝胶成像系统下观察电泳条带情况。
【文档编号】C12Q1/68GK106011247SQ201610382167
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】姜毓君, 满朝新, 娄彬彬, 潘瑞丽, 周彦宏
【申请人】东北农业大学