从分子阵列制备复制物或衍生物的装置和方法、及其应用
【专利摘要】本申请涉及从分子阵列制备复制物或衍生物的装置和方法、及其应用。一种制备分子阵列的复制物或衍生物的方法，所述阵列包括分离的分子样品的空间排布，所述方法包括为每个样品形成至少一个与其他样品的有效区域分离的空间受限的有效区域、位于有效区域边界上的载体的具有结合接头或结合性质的表面。通过有效区域内的扩增剂扩增所述分子用于产生所述样品的复制物或衍生物。通过结合接头或结合性质使所述样品的复制物或衍生物结合至载体，从而使所述载体上样品的复制物和衍生物的空间排布对应于阵列中样品的空间排布。从所述阵列除去包含样品拷贝的载体。
【专利说明】
从分子阵列制备复制物或衍生物的装置和方法、及其应用[0001]本申请是申请日为2010年3月5日的题为“从分子阵列制备复制物或衍生物的装置 和方法、及其应用”的中国专利申请N0.201080019880.7的分案申请。
技术领域
[0002]本发明涉及从分子阵列例如生物分子或化学方法制备的分子制备复制物或衍生物的方法，特别是涉及适合用于制备所述分子的微阵列的复制物或衍生物和/或从其衍生的分子，例如DNA微阵列、RNA微阵列或蛋白质微阵列的此类方法和装置，还涉及所述阵列用于鉴定与涉及一级序列的反应相关的DNA序列、其拷贝或其衍生物的应用。【背景技术】
[0003]微阵列可理解为表示许多不同的生物分子在单个点的表面上或表面内的排布。所述点还被称作斑点并且通常具有lOym-约1000WI1的直径。一个斑点内存在一个或数个相同的生物分子群。但是除了一些有目的的冗余之外，各种斑点表示不同的生物分子。生物分子可沉积在表面，可存在于表面上的层内，可存在于腔室内，或者以固定化方式存在于颗粒上或颗粒内，有可能将所述颗粒排布成阵列。
[0004]按照常规，有许多制备微阵列的方法。根据一项技术，例如使用光合成、化学合成、 斑点合成、印刷法(printing process)等直接在表面合成生物分子(原位合成)。例如 Affymetrix应用此类光合成技术，Agilent可进行斑点合成。Combimatrix通过真实的可电寻址的反应室制备DNA微阵列。根据另一项技术，首先合成(生物)分子，然后以排布的阵列沉积到表面上，此类技术被例如八8；[16111:、668；[1]1和13；[〇；^111(111使用。两种技术均需要高额的技术费用。所述技术费用随着不同生物分子数量的增加和沉积斑点直径的减小而高于线性程度地增加。另外，当此类微阵列预包含例如两倍的物质，或者如果预减小包被结构即斑点的尺寸，所需要的时间和花费会显著增加。用于制备微阵列的印章技术(s t amp i n g technique)记载于[1] 〇
[0005]通过在阵列上原位合成有可能制备数百万不同的DNA序列。但是，为了实现新的布局或者不同的谱型尺寸(图案尺寸，pattern size)，就必须重新组织整个生产过程。这将需要新的仪器设置并且在光辅助合成中甚至需要新的光刻掩膜或者重新设置数字镜像系统的程序，参见[2]，其中记载了利用数字镜像产生微阵列。应尽可能避免这一情况以降低成本。
[0006]仅由于时间的限制就不可能通过在实验室内合成并且随后例如通过纳米点样仪转移至微阵列而转移数万种物质。需要花费数周或数月的时间用上百万不同的生物分子才可在微阵列上制备可评估数量的斑点。在这一时间内表面化学将会改变并且整个微阵列不再有效。
[0007]因此，需要一种方法使得有可能以简单并且不昂贵的方式拷贝已有的微阵列，即复杂并且制备成本昂贵的已知生物分子的常规排布。
[0008]已提出了与该问题相关的一些基本观点，[3]和[4]。[3]和[4]公开了复制寡聚核苷酸阵列的方法，其中将一种或多种生物素-功能化的寡聚核苷酸与一种或多种寡聚核苷酸杂交并且在第一基片(衬底，substrate)上扩增。然后用链霉亲和素将生物素功能化的并且扩增的寡聚核苷酸锚定至第二基片。可通过机械力将生物素功能化的寡聚核苷酸与所述寡聚核苷酸分离从而产生复制的阵列。但是，此类拷贝方法昂贵并且需要另外的生物化学锚定系统并且在许多情况下仅能够制备原始DNA阵列的负拷贝。
[0009][5]还记载了通过使用链霉亲和素/生物素系统拷贝DNA阵列。[6]记载了如何将 DNA拷贝到RNA中。
[0010]约30年以来，一直在实验室内扩增DNA。特别是聚合酶链式反应(PCR)几乎成为所有实验室的标准技术并且是大多数遗传学研究的基础。但是，还有其他技术能够扩增DNA， 例如NASBA、重组酶聚合酶扩增、滚环扩增和各种其他等温扩增技术。[0〇11] 所述技术不仅能够扩增DNA而且还能够实现单个DNA区域或DNA子集的靶向扩增。 通过特定地选择起点(引物)，还可以特异扩增单个DNA区。大多数DNA扩增过程发生在溶液中并且将其称作液相反应。但是，近几年内出现了数种利用另外的固相进行DNA扩增并且在该过程中在所述固相上富集所扩增DNA的方法。例如在玻片或固相上进行的引物延伸反应 [9，10]。下文描述了两种最常用的方法，S卩DNA桥式扩增和油包水乳液扩增PCR的依据。 [〇〇12] DNA桥式扩增:对于桥式扩增，首先用已知的所谓接头序列在两端延伸(部分已知的)DNA。所述延伸物充当表面上的互补序列的结合位点。只有结合至表面之后才会出现扩增。然后将已拷贝的并且因此是新产生的DNA链固定(共价)结合至表面并且在其非结合末端具有另一个结合位点。所述另一结合位点还可结合至表面上的适合的对应物并且起始另一扩增，其进而产生结合在一个末端的新DNA链并且在另一游离末端具有原始结合序列。在该方法中，能够以指数方式产生越来越多的新链，它们在一个末端被固定结合，它们的另一末端使能够与表面暂时结合。在扩增过程中，原始链的一端被固定(共价)结合，另一端松散 (非共价)结合，因此形成分子桥。就这一方面而言，[11]一般性记载了桥式扩增，[12]记载了利用桥式扩增进行测序。
[0013]对于油包水乳液PCR，使用一种类型的桥式扩增。与桥式扩增相似，其涉及首先通过接头序列在两边延伸DNA链。然后将延伸的DNA与水性PCR混合物和固相颗粒-也称作珠粒-混合并且在油中乳化，从而得到油包水和颗粒的乳液。对于该油包水乳液，选择浓度使得理想地每一滴水中精确地包裹一条DNA链和一个颗粒。根据桥式扩增，颗粒表面包含使 DNA拷贝能够与其共价结合的序列。在该方法中，通过扩增可用原始DNA的拷贝覆盖整个颗粒。该技术主要用于测序仪中。在该技术中，每次仅在固相或液相上扩增一条确定的链。 [〇〇14]在蛋白质扩增或蛋白质合成中，存在通过适合的生物化学系统可被首先基本转录至RNA然后转录至蛋白质的DNA链。如果RNA是足够稳定的，或者有足够数量的DNA模板，则可制备大量的蛋白质。该技术对应于发生在细胞内的涉及从DNA经RNA产生蛋白质的天然过程，并且它是生物化学的基础和中心法则。近期以来可获得简化的生物化学系统，其能够完成这一复杂的任务并且因此至少在理论上使能够在实验室中从DNA链制备蛋白质。就这一方面而言，[7]记载了从DNA微阵列直接制备蛋白质微阵列的方法，[8]记载了用cDNA锚蛋白制备蛋白质阵列的方法。可替换地，还可使用向其中引入了蛋白质编码DNA的原核或真核细胞进行蛋白质扩增。
[0015]对于DNA序列的解码，可采用所谓的测序法，相对近期的测序法的综述提供于[13]。另外，DNA结合至颗粒的测序法记载于[14]。
[0016]用于测序的高度复杂的仪器采用多个反应步骤和技术用于首先包裹已分离的 DNA，将其扩增，然后逐个读取其构建单位。通过所选择的反应化学和测序方法，有可能借助昂贵的生物信息学方法以整体重新计算DNA序列并且因此获得所研究物种的基因组。[〇〇17]前文所述测序技术包括在凝胶中分离(split)DNA。这是一种不基于固相的方法并且被称作Sanger测序法。使用最新一代的测序仪人们可以利用油包水乳液PCR并且生成数百万个分别携带不同DNA片段的相同拷贝的颗粒，例如珠粒。对于读取序列而言，将颗粒排列在例如具有130-340万个不同微腔的所谓PicoTiterPlate?中并且将其固定化。这已经表现出像这样的微阵列。就这一点而言，请参考[15]，其中记载了利用桥式扩增测序。[〇〇18]尽管在该方法中已制备了生物分子的常规排布，但是还不能像具有已知序列的常规微阵列那样来使用，因为与颗粒结合的生物分子的单个序列本身还是未知的。但是，测序后可以知道结合至具体颗粒的DNA片段自身的序列。[〇〇19]已尝试回收单独的颗粒并且将它们重新用作阵列，例如柏林的Scineon和Max-Planck-1nstitut fiir Molekulare Genetik[Max-Planck-Society for Molecular Genetics]。但是，该方法昂贵并且仅能够制备此类阵列的一个样本。[〇〇2〇]软刻技术(soft lithography)或微接触印刷(microcontact printing)是能够将分子沉积到表面上并且随后转移至另一表面的印章技术。它还能够整合小的腔室或者微流体并且因此提供复杂的液体回路。所述回路使能够以特定的方式处理表面并且因此包被或修饰非常小的结构。用于这一目的的材料为硅树脂(PDMS)。通过对TOMS进行适合的表面修饰，可将各种生物分子添加至表面并且之后将它们转移。可以转移DNA和RNA以及生物分子。
[0021]尤其可利用这些转移性质用于拷贝步骤，[16]最早记载了如何使用软刻技术转移生物分子。[〇〇22] DNA阵列或DNA微阵列主要用于所谓的表达分析、测序和基因量或SNP分析。
[0023]在表达分析中，人们希望可以研究具体基因的活性水平。mRNA被认为是这一活性的标志物。为达到这一目的，通过例如给药、改变环境因素、将它们置于应激(应力)之下等刺激细胞或生物体。首先从生物材料收集mRNA，将其转录至所谓的互补DNA(cDNA)，并且为其提供染料。为参比样品提供不同的染料。大多数情况下使用绿色和红色染料。将相等比例的样品混合在一起并且将它们应用至微阵列。如果在两种原始样品中以相等的浓度包含特异的DNA序列，则来自两种样品的互补分子会以相等的浓度结合至各自的微阵列斑点。因此读取这一斑点可得到第二种颜色。在使用绿色和红色的情况下，会得到黄色。如果存在不等比例的相同的基因序列，微阵列上的对应斑点将包括其显色表示优势基因产物的第二种颜色。被完全开启或关闭的基因将仅具有一种或另一种颜色(hue)。颜色谱型使能够推断mRNA 的量并且为所研究影响因素对特异基因的活化或钝化程度提供线索。[17]公开了通过高平行测序将表达谱应用于全基因组(genome-wide)研究。
[0024]在SNP分析中，人们可研究基因序列是否包含单个突变，即除一个碱基对之外相同的序列(单个碱基对置换=单核苷酸多态性)。对被置换碱基对的精确定位可以说明该置换是否对生物体不具有或者仅具有很小的影响，或者是否为致命的基因缺陷。在数种严重的遗传病例如亨廷顿舞蹈病、帕金森病或阿兹海默氏病中，已知存在此类严重的SNP。利用许多其他SNP，人们可以推断患具体疾病例如糖尿病或佝偻病的风险或易感性增加。对于SNP分析，直接从生物材料收集DNA并且用染料标记。对于每个SNP，微阵列上存在四个斑点，它们在每一种情况下的相同位置存在一个碱基对差异。基于结合位点，人们可以确定哪一个碱基存在于未知样品的相关位置中，参见[17]。
[0025]对于蛋白质阵列而言，单是制备就更加困难，因为与DNA不同，蛋白质具有非常宽范围的溶解性、反应性和特异性。因此，使用相同的化学锚(chemical anchor)难以将各种蛋白质结合至表面。通常，蛋白质阵列包含数百至一千种不同的蛋白质。蛋白质阵列主要用于结合研究。这包括将标记分子置于蛋白质阵列上。因此微阵列上包括显色的此类斑点是所研究分子的潜在的结合配体(结合伴侣，binding partner)。尤其可将该技术用于表位定位以找出特定的结合位点。[〇〇26]此类微阵列的结构记载于[18]。
[0027]因此微阵列的应用广阔且多样。但是由于缺少必要的经费来源，或者由于它们的成本-效益比，它们的使用受到很大限制。[〇〇28] DNA序列包含生物化学信息并且可以通过生物化学复制系统扩增。已对各种拷贝 DNA序列的方法进行了研发，从将单个的碱基对拷贝到表面上到[4]、[5]和[6]中记载的方法，它们列出了原理上如何将DNA从一个表面拷贝到另一个表面。[〇〇29]而且，文章[7]近期公开了如何从DNA阵列制备蛋白质拷贝。[〇〇3〇]以上阐释显示了现有技术使制备微阵列的两项基础技术成为可能，即一方面为原位直接制备物质，另一方面为通过显微喷印(microscopic dispense)或印刷法在合成后将物质转移。这些技术中的每一种都是复杂的技术并且消耗大量的时间和成本，一般的规律为随着底物数量加倍，所需时间和成本将至少加倍。另外，对于DNA阵列而言，在合成前获得序列的准确生物化学信息是必要的。对于DNA而言，为了获得所述信息，如上文所述需要使用所谓的测序仪。测序和构造微阵列之间的直接制备链仍是未知的或者还未建立。这意味着必须首先将未知生物体测序，之后从测序仪的数据计算序列，接下来才可以制备阵列。通过这一阵列可立即研究表达谱型。另外，已知可从已知序列制备蛋白质阵列。该制备链耗时长并且昂贵。[〇〇31]如果可以通过简单的方法直接以DNA阵列的衍生物生成蛋白质阵列，将可以保留表型和基因型之间的偶联，并且有可能以空间分辨方式(spatially resolved manner)对衍生物进行反应(抗原-抗体，酶促反应)并且将它们与相关的DNA序列联系起来。
【发明内容】
[〇〇32]本发明的目的是提供能够以较少的时间和成本消耗从分子阵列制备复制物或衍生物的方法和装置、对应的复制物或衍生物以及此类复制物或衍生物的应用。[0033 ]根据本发明，通过权利要求1的方法、权利要求23的复制物、权利要求34的装置以及权利要求24、28、30和32的应用实现这一目标。
[0034]本发明的实施方式提供制备分子阵列的复制物或衍生物的方法，所述阵列包括分离的分子样品的空间排布，所述方法包括:
[0035]为每个样品形成至少一个与其他样品的有效区域分离的空间受限的有效区域，位于有效区域边界上的载体的具有结合接头(binding adapter)或结合性质(binding property)的表面；
[0036]通过有效区域内的扩增剂扩增生物化学分子用于形成样品的复制物或衍生物； [〇〇37]通过结合接头或结合性质使样品的复制物或衍生物结合至载体，从而使载体上样品的拷贝或衍生物的空间排布对应于阵列中样品的空间排布；以及
[0038]从阵列除去包含样品拷贝的载体。
[0039]本发明实施方式提供通过使用对应的方法制备的分子阵列的复制物或衍生物。
[0040]本发明实施方式提供制备分子阵列的复制物或衍生物的装置，所述阵列包括分离的分子样品的空间排布，所述装置包括:
[0041]为每个样品形成至少一个与其他样品的有效区域分离的空间受限的有效区域、位于有效区域边界上的载体的具有结合接头或结合性质的表面的装置；[〇〇42]用于通过在形成样品的复制物或衍生物的有效区域内的扩增剂来扩增生物化学分子，以及用于通过结合接头或结合性质将样品的复制物或衍生物结合至载体从而使载体上样品的拷贝或衍生物的空间排布对应于阵列中样品的空间排布的装置;以及
[0043]从阵列除去包含样品拷贝的载体的装置。
[0044]根据本发明，使分子阵列例如DNA微阵列的每个样品具有与其他样品的有效区域分离的空间受限的有效区域，以使本发明能够以快速、简单并且不昂贵的方式制备对应阵列的复制物或衍生物同时保留空间排列提供的位置信息。
[0045]具体而言，本发明实施方式涉及对应的方法和装置，其中所述分子为生物分子或合成制备的化学分子。根据本发明，复制物可理解为表示原始分子的1:1拷贝，而衍生物可理解为表示原始分子的改变，例如原始分子的子代或者子集。根据本发明，分子样品可理解为表示排布在阵列的不同位点的不同分子，或者排布在那里的不同的分子混合物。
[0046]本发明实施方式使能够拷贝微阵列而不需要了解任何生物化学信息，这意味着还能够拷贝特别是非合成的微阵列。这使得能够从测序仪中拷贝出存在于其中的DNA排布的拷贝，并且因此无需任何序列信息而提供DNA阵列。[〇〇47]因此，本发明实施方式使能够在测序步骤之前、之后或之中，甚至在不具有单个样品的任何序列信息的条件下制备对应的微阵列。因此，可以避免合成产生阵列中耗时且昂贵的方法步骤并且可以从测序直接制备阵列。因此本发明实施方式使能够快速扩增特定的微阵列或包被谱型并且不依赖是否已知微阵列的任何生物化学序列或信息。由于不同的生物分子例如DNA、RNA或蛋白质被用于不同的生物化学研究，所以本发明实施方式还使得能够按照不同的任务设置的要求从一个相同的原始样品制备不同的变体。至今为止，还不能在测序过程之前、之中或之后制备适合的DNA微阵列或者甚至是蛋白质微阵列。
[0048]本发明实施方式使能够在测序过程之前、之中或之后通过生物化学拷贝法从一级材料例如一级颗粒阵列直接制备二级微阵列，以及视需要再次将所述二级DNA微阵列以另一阵列的形式生物化学法定位至DNA、RNA或蛋白质。另外，在不同的拷贝步骤中，能够以化学形式制备阵列变体，其包含例如与彩色拷贝可比的特异标记或序列，仅有图中的黄色部分可以被拷贝。[〇〇49]本发明实施方式涉及从来自测序过程(例如ABI或Roche454测序仪中的颗粒阵列) 的DNA序列排布制备微阵列拷贝，迄今为止还未被记载或实施。尽管在现有技术中描述了单个的子步骤，例如从DNA到DNA或者从DNA到蛋白质的生物化学拷贝，但是将单个子步骤组合用于从测序过程制备微阵列仍然是未知的。具体而言，测序，然后通过构造来自测序仪的DNA阵列的复制物制备DNA阵列，接着从DNA阵列制备RNA阵列或者蛋白质阵列这一制备线仍是未知的。
[0050] 如上文所述，从正在进行的测序过程制备DNA阵列对于现有技术而言仍是未知的。 而且，迄今为止未记载直接拷贝所述DNA阵列并接着通过选择修饰将其改造成DNA子集或 RNA微阵列，然后至蛋白质阵列。本发明实施方式首次使能够在测序过程中制备DNA阵列并且立即将其转化成任何所需的阵列表面从而使能够进行任何常规的微阵列研究。在本发明的实施方式中，通过这一方式可完全避免费力的合成制备微阵列。[〇〇51]但是本发明实施方式不限于从测序过程拷贝微阵列。本发明实施方式使能够以简单的方式和低成本直接拷贝平面微阵列，例如可商购的微阵列。本发明实施方式使能够选择性拷贝出阵列的各方面并且将其转录从而产生RNA、DNA子集、CDNA或蛋白质阵列。[〇〇52]适合的拷贝方法例如适合的扩增方法(例如PCR、等温扩增、NASBA)和各自的匹配结合接头或表面的结合性质(例如引物、链霉亲和素/生物素、抗原-抗体、聚组氨酸/镍络合物、静电/动力学或磁性性质)对于本领域技术人员是显而易见的并且不需要在本文中进一步解释。就这一方面而言，还可参考引言中提及的文件，其在该问题上的教导通过引用纳入本文。[0〇53]根据本发明的实施方式，从被称作一级阵列(primary array)的遗传信息制备至少该遗传信息例如DNA的一个拷贝，所述拷贝可称为二级阵列(secondary array)。可从该拷贝制备可称作三级阵列的又一阵列拷贝。所述三级和/或二级阵列可以为相同的拷贝、互补的拷贝、子集或RNA或蛋白质阵列，视一级和/或二级阵列所选择的生物化学复制系统而定。[〇〇54]在本发明的实施方式中，所述一级阵列来自DNA测序仪。基本上可考虑使用任何商购的基于颗粒的测序仪。但是在可替换的实施方式中，可将任何平面DNA微阵列用作预拷贝的一级阵列。本发明实施方式涉及从任何一个平面到另一个平面的任何“拷贝过程”，只要阵列的每个样品具有与其他有效区域分离的空间受限的有效区域。这包括包含生物化学信息的以空间分辨方式归序(order)的任何物质文库，除平面微阵列之外其还包括非平面表面或颗粒阵列，例如在测序仪或化学物质文库中制备的那些。
[0055]在本发明的实施方式中，所使用的扩增剂可为任何已知的扩增剂。前文所述扩增的目标为扩增特异的DNA区段或序列。基于此类已知的扩增，通常不能保留有关在何处产生具体链的位置信息，因为所述扩增在溶液中进行。相反，在本发明实施方式中，可以在复制物的制备中完全或部分保留从复制源即一级阵列到拷贝即二级阵列的位置信息，因为每个样品具有与其他样品的扩增剂区域分离的空间受限的扩增剂区域。该位置信息还常常被称作注册信息(registrat1n)。这应理解为表示例如在规则的网格中由具体DNA区段的排布 (行和列，或者x和y位置)限定的位置。由于所述至少部分保留的位置信息，本发明使能够制备高质量的复制物。保留的位置信息越多，复制物质量越好。当制备多个拷贝时，低空间分辨将产生质量不断降低并且最后在某一点变得无用的拷贝。
[0056]根据本发明，通常可应用任何已知的扩增方法;在一些实施方式中，可使用PCR或桥式扩增。可在表面上使用桥式扩增。在本发明的实施方式中，所述拷贝方法因而代表了某种桥式扩增，但是其发生在一个表面到另一个表面，并且保留了已拷贝物质的位置信息或注册信息。在可替换实施方式中，可使用另外的结合系统用于将拷贝结合至载体，例如[4]中记载的链霉亲和素/生物素系统，但是这使得复杂性增加。
[0057]在本发明的实施方式中，可将结合接头排布在预先将阵列拷贝至其上的载体的整个表面上。
[0058]在本发明的实施方式中，结合接头是与待拷贝分子的序列互补的引物。
[0059]在本发明的实施方式中，通过将与各种样品相关的扩增剂区域空间分离或区室化实现位置信息的保留。在该方式中，可防止单个分子脱离“微室”，从而保留了空间分辨或注册信息。如本文已阐述，在本发明的实施方式中，可将任何扩增技术视为拷贝方法，例如PCR或等温扩增。在拷贝过程中，将复制物沉积到目标表面并且锚定。除了可以完全或部分保留遗传信息外，还可保留位置信息。本发明实施方式提供1:1复制物，通常可将其理解为表示表面的“简单”拷贝。在该方法中，产生具有可能的最高相似度水平的原始物拷贝。在微阵列情况中，人们可在拷贝过程之后从DNA阵列获得另外的DNA阵列。
[0060]本发明实施方式使能够制备阵列的空间复制物，即衍生物。空间复制物或空间拷贝应理解为表示拷贝信息的特异选择。例如，在拷贝DNA阵列的过程中，可通过选择载体包含的作为结合接头的引物仅扩增特异类型的DNA。在该方法中，获得了包含所需信息的子集，例如包含特定序列或特定启动子的所有DNA链。
[0061 ] 相似地，衍生物被称作DNA拷贝向RNA或cDNA，或者RNA向DNA、cDNA或向蛋白质的“转化”。在该背景中，将生物化学信息从一种类型的分子转化至另一类分子，并且仍然保留位置信息。
[0062]在本发明的实施方式中，通过固体结构形成形式为空间受限的扩增剂区域的受限有效区域，而在本发明的可替换实施方式中，不同粘度水平的液体之间的相界(phaseboundary)有助于产生空间受限的有效区域。
[0063]另外，就与其他分子或颗粒的反应或相互作用以及反应催化而言，本发明实施方式涉及对应的复制物和衍生物用于分析目的的应用。
【附图说明】
[0064]下文参考附图更详细地阐述本发明的实施方式，其中:
[0065]图1A-1D示出了举例说明本发明方法的实施方式的示意性横截面图；
[0066]图2示意性显示了一部分PicoTiterPlate的俯视图；
[0067]图3示意性显示了包含DNA颗粒的测序仪芯片的横截面图；
[0068]图4A-4C示意性显示了用于举例说明本发明方法的另一实施方式的横截面图；
[0069]图5A_f5D示意性显示了用于举例说明本发明方法的另一实施方式的横截面图；
[0070]图6A-6D示意性显示了用于举例说明本发明方法的另一实施方式的横截面图；
[0071 ]图7示出了用于举例说明本发明另一实施方式的示意图。
【具体实施方式】
[0072]参考图1A-1D，下文将描述发明方法的一个实施方式，其中一级阵列以测序仪芯片(sequencer chip) 10的形式存在。测序仪芯片10包含多个微腔12。包含微腔12的一部分测序仪芯片10的示意性俯视图显示于图2。所述微腔的直径可为44μπι或29μπι，例如如图2所示。所述测序仪芯片可为例如Roche的454测序仪的测序芯片(GS FLX 2005和/SGS FLX钛2008) ο
[0073]每个腔体12具有沉积在其中的颗粒14，每个所述颗粒14携带单个DNA链16的数百万个拷贝。包含腔室12的测序仪芯片10的示意性横截面图显示于图3，其中腔室12具有的颗粒14包含引入其中的DNA链16。至今为止，在测序过程结束后即将测序芯片丢弃并且因此成为测序过程的“废物”。
[0074]在图1-3描绘的实施方式中，将该芯片用作制备复制物的一级阵列。从腔室12拷贝出该DNA。为了达到这一目的，首先用扩增剂例如PCR混合物(mix)填充腔室。接下来如图1B所示沉积载体20，其密封腔室12并且携带与扩增剂匹配的结合接头，以图1B中的斑点22示意性显示。一旦腔室12被盖子20遮盖，由此为每个样品即具有与其结合的DNA链16的每个颗粒14形成了空间受限的扩增剂区域24，所述扩增剂区域24与其他样品的扩增剂区域24分离。结合接头22位于这些扩增剂区域24的边缘。例如，结合接头22是与PCR混合物匹配的引物。所述引物为DNA聚合酶的结合位点。图1B示出了聚合酶步骤之后的状态，其中生物化学拷贝是由颗粒的DNA组成。这些拷贝以图1B中的虚线18表示。例如，通过选择引物，在该步骤中被用作扩增剂的酶混合物可产生互补DNA即负拷贝。
[0075]接着通过例如加热测序仪芯片和排列于其中的腔室从颗粒14释放已制备的DNA拷贝18。之后，通过例如冷却测序仪芯片促使释放的拷贝18结合至结合接头22。拷贝18结合至结合接头22并因此结合至载体20的结果描绘于图1C。在将拷贝复制至载体20的这一步骤中，保留了位置信息或注册信息，因为为每个样品提供了空间受限的扩增剂区域24并且扩增剂区域24相互之间是分离的。
[0076]接着从测序仪芯片10除去具有与其结合的DNA拷贝18的载体20，并且其表示排布在测序仪芯片1的腔室12内的DNA颗粒14、16的复制物。包含DNA链16的颗粒14保留在腔室12内，从而所述腔体可再次充当用于使用新载体的新拷贝过程的一级阵列。在该方法中，基本可以产生任何数量的拷贝。可将具有与其结合的DNA拷贝18的载体20用作例如转录组分析、检测蛋白质与DNA、RNA与DNA或者甚至是RNA与RNA结合的生物芯片。
[0077]为了在拷贝过程之后再次制备用于另一拷贝循环的一级阵列(测序仪芯片10)，可以替换或除去腔室内的扩增剂，例如PCR混合物。为了避免污染，用还可能包含酶(例如可消化特定DNA产物的尿嘧啶N-糖基化酶)的洗涤步骤除去PCR产物并且使更多的此类拷贝不会污染最初的主要物质(original master) ο
[0078]图4A-4C描绘了本发明方法的另一实施方式，其中常规平面微阵列充当一级阵列。将平面微阵列排布在阵列基片30上并且包含所需的DNA样品。所述DNA样品具有二维空间排布。对于拷贝DNA样品的过程，提供包含腔室36的微结构34。为每个DNA样品32提供至少一个腔室36。为了获得相对较高的分辨率，在可替换实施方式中，在每种情况下为每个DNA样品32提供多个相对小的腔室36。腔室36具有排布于其中的结合接头38。
[0079]用扩增剂例如聚合酶混合物填充腔室或微腔36。然后将微结构34沉积到微阵列30上，以致阵列基片30将腔室36封闭(较小的距离也是有效的但是会增加腔室之间的污染)，从而使DNA样品排布在与它们分别相关的腔室36内。在该方法中，再次为每个DNA样品形成与其他样品的扩增剂区域分离的空间受限的扩增剂区域35。再次通过与聚合酶混合物匹配的引物再次形成结合接头38。
[0080]在产生了如此封闭的扩增剂区域35之后，再次进行诸如聚合酶步骤的扩增，其中将DNA样品32扩增并拷贝至腔室36内。将拷贝的DNA锚定至结合接头38，如图4B中DNA 42所示意性显示的。为了实现这一目的，还可相应地控制具有排列在其中的DNA样品的腔室的温度。最后，从微结构34除去具有位于其中的DNA样品32的DNA基片30，从而使具有拷贝DNA 42的微结构34代表了原始微阵列的一个复制物。现可将荷载有拷贝的DNA 42的微结构34用作进一步拷贝步骤中的模板，所述拷贝步骤可与例如上文参考图1A-1D描述的方法相似地进行。在该情形中，可构造微结构34使得在拷贝过程之后它具有与测序仪芯片例如来自Roche454测序仪的测序仪芯片相同的性质。
[0081]—种实施方式可包括上文所述实施方式的方法的组合。首先，通过根据上文图1A-1D的拷贝过程将测序仪芯片用于制备包含完整DNA微阵列的平面载体。接着，根据参考图4A-4C描述的实施方式将该载体再次拷贝。此时可根据例如图1A-1D的方法将被DNA占据的微腔(图4A-4C中的微腔36)用于制备另外的DNA拷贝。或者，可将被DNA占据的微腔用于制备形式为互补DNA、DNA亚组、截短的、延伸的或修饰的DNA或者甚至RNA至蛋白质的被修饰的拷贝。在该方法中，可制备任何包含DNA、RNA或蛋白质或肽的区域。
[0082]现参考图5A-?描述本发明方法的另一实施方式。在该实施方式中，通过油包水乳液PCR将DNA扩增至单个颗粒50中。每个颗粒上锚定一种类型的DNA(与用于545测序或者ABISOLID测序仪中的珠粒的制备相似)。将所述颗粒置于载体52的表面。更具体而言，将颗粒50置于各自的液滴54中，例如水滴。通过油膜56将水滴相互分离。因此水滴有助于限定空间受限的、相互分离的扩增剂区域54’(图5C)。可通过亲水涂层将水滴54结合至载体52表面上的各自的位置上，从而以确定的空间排布将它们排布在载体52上。例如，载体52可包含对应于生物化学分子样品的排布的常规谱型的亲水斑点。在每种情况下水滴54具有被引入其中的扩增剂。因此，为形式为包含与其结合的DNA的颗粒50的每个样品提供空间受限的扩增剂区域，其通过液体例如水和油之间的相界与其他样品的扩增剂区域分离。如图5B所示，提供了包含结合接头62的载体60。将包含结合接头62的载体60压到油膜56上，从而置换出比水更为稀薄的油，从而使载体60不以包含结合接头62的表面与水滴54接触。在该过程中可容易的挤压所述水滴54，如图5C所描绘。
[0083]接着，通过扩增剂扩增结合至液滴54内的颗粒的DNA从而产生DNA拷贝。所述DNA拷贝64结合至结合接头62并且将其与载体60—起从基片52除去。因此具有与其结合的拷贝DNA样品64的载体60代表了原始阵列的一个复制物。
[0084]在可替换的实施方式中，可将结合接头提供于基片52上而非载体60上，从而将DNA拷贝到基片52，而载体60仅充当反载体(counter support)。因此该实施方式也使能够使用油包水乳液PCR以颗粒阵列拷贝制备平面微阵列。因此，快速制备DNA阵列成为可能。而且，可制备RNA拷贝、蛋白质拷贝或经修饰的DNA拷贝。
[0085]根据本发明，为待拷贝的阵列，S卩，待产生其复制物或衍生物的阵列的每个样品形成空间受限的有效区域。能够以各种方式实现有效区域的空间形成。在本发明的实施方式中，为每个样品提供空间封闭的腔室。在实施方式中，可提供促进特定方向的扩散而阻止其他方向扩散的空间界限，例如柱形或凹槽(trench)排布。在实施方式中，可使用促进或限制特定方向扩散的多孔材料、扩散限定材料或分子结构，例如水凝胶、气凝胶或聚合物表面。在一些实施方式中，可使用有序或无序的纳米或分子结构，例如分支聚合物(poIymerbranch)、树状聚合物、颗粒阵列、滤膜、脂膜(球形或平面的)以形成空间受限的有效区域。
[0086]在一些实施方式中，可使用还能够产生优选的扩散方向(电泳、光镊、磁泳、表面声波、热泳等)或扩散屏障的物理场，例如电场或磁场，并且因此形成可用于产生空间受限的有效区域的空间分离。例如，可使用磁性液体和“淬火(硬化，harden ing)”磁场，或可分离单个区域的激光网格。
[0087]在一些实施方式中，活化和/或钝化可发生在有效区域内或有效区域外，从而例如通过电场、电荷、PH变化、通过光的钝化/活化、压力等产生空间受限的有效区域。例如，可在受限区域内进行聚合酶的光活化或者通过光产生活化的核苷酸。接着在黑暗区域不发生任何反应。
[0088]在另一些实施方式中，可使用提供具有特定物理作用的空间受限的有效区域的表面结构。例如，在该背景中可提及疏水/亲水区域(例如油和水)或聚合物，由于电场作用其可在特定区域膨胀和硬化，并且因此还可以限定空间受限的有效区域。
[0089]现参考图6A-6D描述其中通过三维结构限定空间受限的有效区域的另一实施方式。如图6A所不，将为阵列一部分的分子样品100排布在阵列基片104的凸起(elevat1n)102上。在凸起102之间在阵列基片104内形成凹陷(depress 1n) 103。将包含形式为固相引物的结合接头108的载体106置于阵列基片104附近，如图6B所示。由于阵列基片104与载体106空间上邻近，所以在凸起102和载体106的对立面之间在凸起102的区域内形成了空间受限的有效区域。相反，凹陷102和载体106的对立面之间的间隔太大，以致于此处无有效区域形成。
[0090]在有效区域内，固相引物和样品100之间的接触使杂交成为可能，从而可起始扩增，如图6C所示。可另外从凹陷处提供用于扩增的物质，如图6C中由箭头112所示。在该方法中，产生了与载体106结合的样品100的复制物，因此产生了由样品100形成的阵列的复制物。
[0091]从图6C描绘的状态开始，现可将阵列基片104和载体106分离，样品100仍然在阵列基片104上并且复制物114与载体106被除去。另外的拷贝可由位于阵列基片104上的阵列或者位于载体106上的复制物组成。
[0092]在参考图6A-6D描述的实施方式中，扩增和转移至载体基本同时发生。在可替换的实施方式中，如果转移和扩增相互分开进行，可在较大的表面区域上进行一个步骤，而以空间受限方式进行另一步骤。
[0093]在参考图6A-6D描述的实施方式中，通过所述结构并且在引物存在下产生空间受限的有效区域。在该背景中，所述反应对应于桥式扩增。使表面之间相互产生物理接触。由于空间相邻，其中的DNA被拷贝至其他表面的“有效区域”在凸起处形成例如柱形(column)的顶点。接着，甚至可除去所述顶点，因为接下来的扩增为限定其自身有效区域的典型桥式扩增。但是，仅空间有效区域的起始条件可以起始反应。该反应可称作边缘或顶点扩增。所述空间边缘或顶点使反应起始。边缘旁边的空闲空间为反应提供任何所需的物质。
[0094]在可替换的实施方式中，与图6A-6D不同，可将待拷贝的阵列排布到平面基片上，而在将阵列拷贝至其上的载体上形成凸起。再次可替换地在阵列基片和载体上形成凸起。
[0095]关于如何通过能量场(energy field)例如磁场或电场产生空间受限的有效区域的实施方式描绘于图7。图7仅示意性显示了阵列基片120和载体122。为简略起见，未描绘待拷贝的阵列基片120上的分子样品和载体122上的结合接头。在分子样品各自的区域内，排布场生成装置124，将其构造成能在排布于阵列基片120和载体112之间的扩增剂内生产能量场12 6。在该方式中，产生空间受限的有效区域12 8，其中扩增剂被活化，而剩余区域内的情况并非如此。
[0096]上文举例说明了本发明方法的实施方式。用于实施本发明方法步骤的对应的装置或方法的实施方式可从说明书获得或者对于本领域技术人员是显而易见的。因此，无需进一步举例说明本发明装置可包括用于设置物理实体例如所需要的各种阵列、载体或基片的适合的操纵装置。另外，没有必要进一步阐述可提供适合的流体装置从而在必要的位置提供各自的液体或试剂。另外，可提供对应的控制器以控制装置实施本发明发方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。还可提供产生实施所述方法所要求的环境的装置，例如温度传感器。
[0097]本发明实施方式特别适用于产生阵列的复制物或衍生物，其中所述分子为单链或双链寡聚核苷酸、多聚核苷酸、DNA或类似DNA的合成分子(PNA)。在本发明的实施方式中，空间平面排布例如微阵列、颗粒空间排布例如测序仪芯片内、腔室空间排布例如在PicoTiterPlate?内或者不同相的空间排布例如单个液滴均可充当一级阵列。另外，还可将基于颗粒的测定法，例如11 Iumina或Applied B1systems (SOLID)公司的测定法视作此种类型的阵列。在实施方式中，可从用于衍生基因组的测序过程，从用于衍生转录组的测序过程(测序程序，sequencing process)，从测序1?嫩(例如1111?嫩41?嫩、811?嫩或一般的RNA)的过程或者从测序突变和变异的过程拷贝生物化学分子例如寡聚核苷酸或多聚核苷酸。在本发明实施方式中，所产生的拷贝可为DNA、经修饰的DNA(延伸的、截短的、人工的、插入物、缺失、突变等)、DNA构建体(表达载体、siRNA)、人工分子(PNA、经修饰的肽)、表达物、RNA或蛋白质，每种情况中均用于制备阵列。
[0098]在本发明的实施方式中，可从用于生成阵列或结构表面的测序过程拷贝寡聚核苷酸或多聚核苷酸。在一些实施方式中，可从用于制备阵列或用于包被表面的颗粒的排布拷贝寡聚核苷酸或多聚核苷酸。在本发明的一些实施方式中，可从表面拷贝寡聚核苷酸或多聚核苷酸用于产生拷贝、用于产生互补拷贝或者用于物理化学修饰所述表面。
[0099]在本发明的一些实施方式中，可将寡聚核苷酸或多聚核苷酸拷贝至另一表面用于化学或生物化学修饰，从而用于基于新表面性质的应用或者用于制备化学物质的生物化学方法链。在本发明的一些实施方式中，可无需测序而拷贝可通过例如油包水乳液PCR制备但是不需要制备的颗粒阵列，用于制备DNA文库阵列，用于制备包含各种DNA突变体的阵列，用于进一步将所述阵列拷贝成RNA或蛋白质，或者在细胞试验中使用所述拷贝。
[0100]本发明实施方式可应用于许多应用领域。此类应用领域的实例为测序、转录物分析、测量DNA、RNA或蛋白质活性、表达研究、采用噬菌体展示、核糖体展示或细胞展示的展示技术以及代谢物研究。另外，本发明可应用于相互作用研究，例如:DNA/DNA;DNA/RNA;DNA/蛋白质;RNA/蛋白质；RNA/细胞;蛋白质/蛋白质；激酶活性;蛋白酶活性;磷酸酶活性;DNA-结合蛋白；表位定位;病原体测定；以及底物或抑制剂的测定。本发明利用阵列侧上大量的相互作用谱型使目前部分无法进行的分析成为可能。
[0101]另外，本发明可应用于疫苗研制领域，一个实例如下文所述。我们假设出现了一种新的病毒/细菌。从第一个存活的生物体采集到细胞样品或血液样品。用所述病毒感染细胞样品，并且分离mRNA。然后将所述mRNA测序，并且从其拷贝出获得的DNA。接着，将DNA阵列转录成蛋白质阵列。在该方法中，所述阵列将包含细胞蛋白质和由于病毒攻击而被修饰的蛋白质。将血液样品置于阵列中，其中包含的抗体与蛋白质结合。只有抗体才会结合至病毒蛋白，因为抗体自身不会与同体蛋白质结合。接着可通过染色步骤鉴定结合的抗体。因此，可测定该病毒的DNA和蛋白质序列。在该方法中，人们可以在非常短的时间内获得关于表位和抗体的结合蛋白质的信息。利用这一信息，可因此立即制备被动或者主动疫苗。在发生流行病的情况下，使用该方法可大大缩短制备疫苗之前的时间。
[0102]因此本发明实施方式使能够进行完整的工作周期，其中将测序过程中制备的DNA序列阵列(一级阵列)转移至表面，并且因此制备该DNA的拷贝(二级阵列)。另外，在一些实施方式中，可另外将所述一级或二级阵列模拟(model)成形式为RNA或蛋白质的另外的拷贝(三级阵列)。在一些实施方式中，可将每个生物化学分子例如DNA的阵列视为一级阵列。而且，通过适当地选择拷贝技术，可制备原始阵列的相同或选择性拷贝。因此，本发明实施方式涉及甚至在基因测序之前、之中或之后定位用于该过程中的阵列，以及可选地在进一步的拷贝过程中将其改造成基因、cDNA、RNA或者甚至是蛋白质阵列。
[0103]本发明实施方式的优点在于甚至在测序过程中可将分子信息以空间分辨的方式复制任意次数。仅需要一个原始物作为用于实现这一目的的主要物质(操纵物质，master)。不需要与原始物的性质相关的信息或其中包含的数据。因此拷贝过程不依赖于所包括的信息。另外，本发明实施方式使能够不需要原位合成或印刷/喷印单元(printing/dispensingunit)而制备微阵列或者拷贝生物化学表面结构。拷贝过程在分子水平进行并且使用已良好确立的生物化学系统。由于保留了位置信息，拷贝过程使生物化学信息的高度平行处理成为可能。这使得能够在分子水平将不同类型的微阵列联系起来并且避免了在获得序列信息后进行耗时且昂贵的微阵列制备。
[0104]在本发明的一些实施方式中，有助于限定空间受限的扩增剂区域的微结构或纳米结构包括特别是基于滤膜、水凝胶或气凝胶的无序基质(unordered matrix)。在本发明的一些实施方式中，所述微结构或纳米结构是基于有序的三维基片(ordered three-dimens1nal substrate)。
[0105]在本发明的一些实施方式中，至少部分通过两种液体之间、液体和气体之间的相界或者物理边界特别是脂膜将空间受限的扩增剂区域分离。
[0106]在本发明的一些实施方式中，复制物或衍生物与载体的结合过程可与扩增，或者一部分扩增同时进行，因为固定化结合接头充当扩增引物。另外，衍生物可通过固定化捕获分子与载体结合，或者因为它们保持与用于制备它们的系统结合，并且将所述系统固定化在载体上。该系统可由例如酶、核糖体或细胞组成。
[0107]在本发明的实施方式中，有效区域的空间限定在于结合接头作为互补引物以包括规则或不规则分布的斑点的引物阵列的形式存在于载体上，载体上的斑点大小和斑点密度与阵列上的相等或更小。
[0108]在本发明的实施方式中，将扩增剂设计成可实现DNA扩增特别是聚合酶链式反应、等温扩增，例如NASBA反应，并且所述结合接头包含匹配引物。
[0109]在本发明的实施方式中，从一级阵列或一级阵列的复制物生成一级、二级和/或三级衍生物，因为可将DNA转录成RNA，将RNA翻译成蛋白质，或者因为使用来自液相的已制备的蛋白质、已制备的RNA或者已制备的DNA或其拷贝可富集结合物，或者因为结合物可相互作用。
[0110]在本发明的一些实施方式中，在靶阵列上的固相上生成衍生物并且以固定化形式存在。在本发明的实施方式中，样品的位置上具有另外的分子或DNA序列或细胞，其为样品的一部分或为固定化的并且是生成衍生物所需的，特别是表达载体序列，例如复制起始区(ori)、启动子、核糖体结合位点、起始密码子、内切蛋白酶裂解位点、融合序列、报告子基因、终止子、抗生素抗性基因、体外翻译系统或细胞。
[0111]本发明实施方式涉及使用本发明方法制备的分子阵列的复制物或衍生物，以及此类复制物或衍生物的应用。在本发明的一些实施方式中，此类复制物或衍生物可用于将结合物、特别是蛋白质、抗体或抗原与原始分子、其复制物或其衍生物之间的反应与原始分子的DNA序列联系起来，特别是用于基因型-表型偶联。在本发明的一些实施方式中，此类复制物或衍生物可用于将其中所述原始分子、其拷贝或其衍生物催化底物转化的反应与原始分子的DNA序列联系起来，特别是用于基因型-表型偶联。本发明的实施方式涉及通过此类应用鉴定的DNA序列以及基于此类DNA序列制备的产物或制剂，特别是抗体、抗原、疫苗或抗生素。
[0112]在本发明的实施方式中，将根据本发明方法制备的复制物或衍生物用于检测样品、其复制物或衍生物与相互作用分子或颗粒之间的反应，通过光学、电化学或磁性传感器进行所述检测，并且所述相互作用分子或颗粒携带对应的标记，或者在没有任何标记的情况下通过以下方式进行所述检测:消逝场(evanescent field)或者改变的共振频率的变化，或者应用光镊或者将反应与吸光度特别是沉淀或颜色变化，或者与发光特别是化学发光偶联。在本发明实施方式中，还可将用于检测测序的相同的测序装置用于检测所述反应。
[0113]本发明实施方式涉及对应的复制物或衍生物用于在阵列的复制物或衍生物上进行反应的应用，将包括连接末端的室或流体结构应用至复制物或衍生物的表面，或者将复制物或衍生物引入对应的室内，可在特定的温度将所述室温育并且替换包含于该室内的液体。此类应用还可能发生在也是用于对阵列进行测序的装置中。
[0114]本发明实施方式涉及对应的复制物或衍生物用于同时在所述复制物或衍生物上进行反应和检测的应用。本发明实施方式涉及测序液体-颗粒阵列的方法，从颗粒上包含的样品生成复制物并且在测序装置中对所述复制物进行测序。
[0115]在本发明的实施方式中，可在扩增或结合过程中通过标准的方法读取反应进程。这使得在酶、结合和反应动力学领域的应用成为可能。例如可制备与CO2结合的酶。紧接着通过PH值变化鉴定该酶。相似地，还可鉴定其他酶或催化活性或结合性质。这些包括从仅测量分子的存在到测量其作用方式的任何生物化学测量技术。因此本发明实施方式包括在应用中使用公知的检测方法监测单个有效区域内的物理或化学参数的任何变化，这使得能够一定程度上洞察扩增剂和一级阵列及其衍生物的运行机制，其至今尚未存在。
[0116]本发明实施方式提供使用本发明方法制备的分子阵列的复制物或衍生物用于鉴定DNA序列、RNA序列、蛋白质或催化、信号转导(例如增强、变构、抑制...)或DNA、RNA或蛋白质的酶促(例如裂解、磷酸酶活性、激酶活性...)功能的应用。
[0117]本发明实施方式提供使用本发明方法制备的分子阵列的复制物或衍生物用于鉴定DNA序列、RNA序列或肽序列，以及基于所述DNA、RNA或肽序列产生、鉴定或制备产物、特别是抗体、抗原、疫苗或抗生素的应用。[Ο118]文献目录
[0119][ I ]Yu A.A.等人，“Contact Printing Beyond Surface Roughness: LiquidSupramolecular Nanostamping”,Adv.Mater.2007,19，4338至4342页；
[0120][2]Blanchard A.P.,Friend.S.H.,Nature B1tech(1999)17，953页等.
[0121][3]网站:
[0122]http://www.techno-preneur.net/technology/New-technologies/1ife~sciences/novel.htm
[0123][4]W0 2008/022332 A2
[0124][5]Kim J.,Crooks R.，JACS，128，12076至 12077页(2006)描述使用链霉亲和素/生物素系统复制DNA阵列
[0125][6]Kim J.,Crooks R.，Anal Chem(2007)l ,79:8994-8999页;
[0126][7]He M.等人，Nat Methodes(2008)，5:175-177页;
[0127][8]Ramachandran N等人;Methodes Mol B1l(2006) ;328:1至 14页;
[0128][9]US 6017738
[0129][10]US 6274351 BI
[0130][ 11 ]US专利6，300,070 BI；
[0131][ 12]Abrams E.S.等人，Diagnostic and Gene Detect1n Ch.I.9，171-189页(1997)；
[0132][ 13]Laborwelt，第3版，vol.8(2007);
[0133][14] Shendure J.等人，“Next-generat 1n DNA sequencing”，NatureB1technology，vol.26，N0.10，2008年 10月，1135至 1145页;
[0134][ 15]Handbuch Illumina fiir den Genome Analyser[基因组分析者的启发手册(Illumina Handbook for the Genome Analyzer)](2007)；
[0135][16]Kane R.S.等人，B1materials( 1999)20，2363至2376页;
[0136][17]Torres Τ.Τ.等人，Genome Research,
[0137]http://genome.cshlp.0rg/cgi/content/abstract/gr.6984908vl#otherarticles；
[0138][18]EP 1203945 BI。
【主权项】
1.一种制备分子(16，32，50)阵列的复制物或衍生物的方法，所述阵列包括分离的分子 (16，32，50)样品的空间排布，所述方法包括:为每个样品形成至少一个与其他样品的有效区域(24,35,54)分离的空间受限的有效 区域(24,35,54’)，位于所述有效区域(24,35,54’)的边界上的载体(20,34,60)的具有结合 接头(22,38,62)或结合性质的表面；通过所述有效区域(24，35，54 ’)内的扩增剂来扩增所述分子(16，32，50)，从而产生所 述样品的复制物(18，32，64)或衍生物；通过所述结合接头或结合性质(22,38,62)使所述样品的复制物或衍生物(18,32,64) 结合至所述载体(20,34,60)，从而使所述载体上的所述样品的拷贝或衍生物的空间排布对 应于所述阵列中的所述样品的空间排布；以及从所述阵列除去包含所述样品的复制物或衍生物(18,32,64)的所述载体(20,34,60)。2.根据权利要求1所述的方法，-其中，产生空间受限的有效区域包括产生空间受限的扩增剂区域(24，35)，或-其中，所述空间受限的扩增剂区域(24,35)至少部分地由所述阵列的阵列基片(10)内 或所述载体(34)内的微结构或纳米结构(12，36)限定，或-其中，所述微结构或纳米结构包括特别是基于滤膜、水凝胶或气凝胶的无序基质，或 其中，所述微结构或纳米结构是基于有序的三维基片。3.根据权利要求1所述的方法，_其中，为每个样品产生至少一个空间受限的扩增剂区域(24)包括将所述样品提供于 所述阵列基片(10)内分离地相互关联的凹槽(12)内，将所述扩增剂引入所述凹槽(12)中， 并且用所述载体(20)封闭所述凹槽(12)，或-其中，至少部分地通过两种液体(54,56)、液体和气体之间的相界，或者物理边界，特 别是脂膜，分离所述空间受限的扩增剂区域(54’)，或-其中，至少部分地通过两种液体(54,56)、液体和气体之间的相界，或者物理边界，特 别是脂膜，分离所述空间受限的扩增剂区域(54’)，并且其中，为每个样品产生至少一个空 间受限的扩增剂区域包括将所述样品提供于相互分离的液滴(54)中，所述液滴(54)包含所 述扩增剂并且固定在所述阵列的阵列基片(52)上的空间排布中，在所述液滴(54)之间排布 更为稀薄的液体(56)，并且相对于所述阵列基片(52)排布所述载体(60)，使得所述载体 (60)的具有所述结合接头(62)的表面位于所述液滴(54)的边界上。4.根据权利要求2所述的方法，其中，产生至少一个空间受限的扩增剂区域(35)包括提 供具有至少一个凹槽(36)的载体(34)，将所述扩增剂引入所述凹槽(36)中，以及通过所述 阵列基片(30)封闭所述凹槽(36)，从而使所述样品暴露于所述扩增剂区域(35)，所述凹槽 (36)与每个样品关联并且具有结合接头(38)排布于其中。5.根据权利要求1所述的方法，其中，为每个样品提供空间受限的扩增剂区域包括将所 述样品提供于测序仪芯片(1 〇)或纳米孔板内。6.根据权利要求1所述的方法，-其中，与所述扩增同时进行将所述复制物或衍生物结合至所述载体的过程，或-其中，所述有效区域的空间限定在于:在所述载体上存在作为互补引物、形式为包含 规则或不规则的斑点分布的引物阵列的所述结合接头，所述载体上的斑点大小和斑点密度与所述阵列上的相等或比所述阵列上的更小。7.根据权利要求1所述的方法，其中，通过应用能量场实现所述有效区域的空间限定。8.根据权利要求1所述的方法，其中，以结合至颗粒(14,50)的分子的形式提供所述样品。9.根据权利要求1所述的方法，-其中，所述分子阵列为非合成的生物分子阵列，或-其中，所述分子是单链或双链的寡聚核苷酸、多聚核苷酸、DNA或类似于DNA的合成分 子(PNA)，或-其中，所述阵列由用于衍生基因组的测序过程、用于衍生转录组的测序过程、测序 1^、1111^41^、811^的过程、或测序突变和变异的过程组成，或-其中，通过扩增并结合至所述载体，形成对应于DNA、修饰的DNA、DNA的表达物、RNA、蛋 白质或肽的拷贝，或-其中，所述扩增剂实现DNA扩增，特别是聚合酶链式反应、等温扩增、或NASBA反应，并 且所述结合接头包括匹配引物，或-其中，所述方法还包括监测所述有效区域内的物理或化 学参数的任何变化。10.根据权利要求1所述的方法，其中，样品的位置上定位有另外的分子或DNA序列或细 胞，其为样品的一部分或被固定化，并且其为生成衍生物所需要的，特别是表达载体序列， 例如复制起始区、启动子、核糖体结合位点、起始密码子、内切蛋白酶裂解位点、融合序列、 报告子基因、终止子、抗生素抗性基因、体外翻译系统、或细胞。11.根据权利要求1所述的方法，-其中，从一级阵列或所述一级阵列的复制物生成一级、二级和/或三级衍生物，其中将 DNA转录成RNA，将所述RNA翻译成蛋白质，或者其中使用来自液相的已制备的蛋白质、已制 备的RNA或已制备的DNA或其拷贝富集结合物，或者其中结合物相互作用，或-其中，在靶阵列的固相上生成衍生物并且所述衍生物以固定化方式存在于其中。12.使用权利要求1所述的方法制备的复制物或衍生物在以下中的应用:_用于将结合物特别是蛋白质、抗体或抗原与原始分子、其复制物或其衍生物之间的反 应与原始分子的DNA序列关联起来，特别是用于基因型-表型偶联，或_用于将其中原始分子、其拷贝或其衍生物催化底物转化的反应与原始分子的DNA序列 关联起来，特别是用于基因型-表型偶联，或-用于鉴定DNA序列、RNA序列、蛋白质或催化、信号转导(例如增强、变构、抑制...)或 DNA、RNA或蛋白质的酶促(例如裂解、磷酸酶活性、激酶活性...)功能，或-用于鉴定DNA序列、RNA序列或肽序列和用于基于所述DNA、RNA或肽序列产生、鉴定或 制备产物特别是抗体、抗原、疫苗或抗生素，或-用于检测样品、其复制物或衍生物与相互作用分子或颗粒之间的反应，所述检测通过 光学、电化学或磁性传感器进行，并且所述相互作用分子或颗粒携带对应的标记，或者在没 有任何标记的情况下，通过消逝场的变化或改变的共振频率、或通过应用光镊、或通过将所 述反应与吸光度变化特别是沉淀或颜色变化、或与发光特别是化学发光相结合而进行所述 检测，或_用于在所述阵列的复制物或衍生物上进行反应，包括连接末端的腔室或流体结构被应用至所述复制物或衍生物的表面上，或者所述复制物或衍生物被引入对应的腔室内，可 在特定的温度下温育所述腔室，并且替换所述腔室内容纳的液体，或-用于在所述复制物或衍生物上同时进行反应和检测。13.根据权利要求12所述的应用，其中，还可将用于测序检测的相同的测序装置用于检 测所述反应，或者其中，所述应用是在也用于测序所述阵列的装置内进行。14.一种测序液体-颗粒阵列的方法，从根据权利要求8所述的颗粒上包含的样品生成 复制物，并在测序装置中对所述复制物进行测序。15.—种用于制备分子(16,32,50)阵列的复制物或衍生物的装置，所述阵列包括分离 的分子(16,32,50)样品的空间排布，所述装置包括:用于为每个样品形成至少一个与其他样品的有效区域(24,35,54’)分离的空间受限的 有效区域，位于所述有效区域(24,35,54’)边界上的载体(20,34,60)的具有结合接头或结 合性质(22,38,62)的表面的装置；用于通过所述有效区域(24,35,54’)内的扩增剂扩增所述分子从而产生所述样品的复 制物或衍生物(18,32,64)，并且用于通过结合接头(22,38,62)或结合性质使所述样品的复 制物或衍生物结合至所述载体(20,34,60)，从而使所述载体上的所述样品的拷贝或衍生物 的空间排布对应于所述样品的空间排布的装置;以及用于从所述阵列除去包含所述样品的拷贝的所述载体(20,34,60)的装置。
【文档编号】C12Q1/68GK106011238SQ201610340163
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2010年3月5日
【发明人】罗兰·泽格莱, 斯泰滕 费利克斯·冯, 京特·罗斯, 约亨·霍夫曼
【申请人】弗赖堡阿尔伯特-路德维格大学