一种金银花提取物中掺杂杜仲的鉴定方法
【专利摘要】本发明涉及一种杜仲分子身份证，所述分子身份证中含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。利用本发明所提供的分子身份证和方法可以准确的判定金银花提取物以及以金银花提取物入药的中成药中是否掺有杜仲提取物或杜仲叶，本发明所提供的方法适用性更广，能检测所有能提取出DNA的任何样品。因此，能够实现金银花提取物的快速、准确鉴定。
【专利说明】
-种金银花提取物中惨杂杜仲的鉴定方法
技术领域
[0001] 本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域，具体设及一种应用分子身份证鉴定金 银花提取物中渗杂杜仲的方法。
【背景技术】
[0002] 金银花Lonicera japonica，又称忍冬花，为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开 的花。金银花W花入药，性寒，味甘，具有清热解毒，疏散风热功效。临床用于溫热初期，主治 外感风热，咽喉肿痛之症。金银花含有挥发油，黄酬，Ξ祗类和绿原酸等化学成分，其中绿原 酸具有抗菌、抗病毒、利胆、保肝、降压、兴奋中枢神经系统等作用，能增加肠胃蠕动能力，并 能促进胃液分泌及胆汁分泌等，绿原酸的水解产物咖啡酸亦有增加白细胞和抗氧化作用， 在临床上用于治疗多种急性细菌性感染和放、化疗所致的自细胞减少症有显著效果。由于 金银花中绿原酸的特殊功效，市场上常将绿原酸含量多少作为评定金银花质量好坏的标 准。金银花提取物的规格W绿原酸计，从5%-95%不等。含绿原酸的越高，则价格越高。杜仲 Eucommia ulmoides Oliver为杜仲属唯 种植物，杜仲叶片中绿原酸含量较为丰富，达 1%-5.5%。更易提取，因此成本更低。为了增加金银花提取物中绿原酸的含量，市场上经常 出现将杜仲叶片或者杜仲叶片提取物加入金银花提取物中提升绿原酸浓度的现象。金银花 性寒，味甘，入肺、屯、、胃经，而杜仲性溫，归肝，肾经。二者在功效上有很大区别。应用显微观 察或者化学手段如薄层色谱，高效液相色谱等方法无法准确鉴别金银花提取物中是否渗有 杜仲提取物。由于缺乏标准的监管方法，市场上提取物造假越来越严重，约50 % -80 %提取 物产品存在造假现象。提取物市场被业内人±称为"邪恶市场"。因此，急需要建立一种新金 银花提取物的鉴定方法。
[0003] 分子鉴定已广泛应用于中药材鉴定，而针对提取物而言，DNA降解严重，扩增长序 列存在一定的困难。Shaw等的研究结果表明人参在煎煮两小时后只能扩增获得短片段。本 发明开发了一段杜仲特异的分子身份证，片段长度为34bp，用于鉴定金银花提取物W及W 金银花提取物入药的中成药中是否渗杂杜仲。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服传统鉴别技术中存在的上述缺陷并提供一种结果准确灵 敏，鉴定过程简便快速的杜仲鉴定方法。本发明所利用的分子身份证是根据杜仲单属单种 的特性，在DNA序列中经过筛选和与blastn比对后确定了一段34bp的杜仲分子身份证序列， 该分子身份证具有种内保守、种间变异较大的特点。经过BLAST分析，证明该分子身份证为 杜仲特有，序列相似度为IdentlOO% (见图1)，与其它物种的序列相似度较低。若未知样品 DNA扩增获得此段分子身份证，则可判定样品中含有杜仲。
[0005] 本发明提供了一种从金银花提取物中鉴定是否渗杂有杜仲的鉴定方法，其中，所 述方法包括检测样品基因组DNA中是否存在本发明所述的分子身份证。当存在所述分子身 份证时，鉴定待测样品中渗杂有杜仲提取物或杜仲叶。
[0006] 可选的，所述方法包括如下步骤：
[0007] 1) W待测样品的基因组DNA为模板，对所述分子身份证进行PCR扩增，获得扩增产 物；
[0008] 2)对扩增产物进行测序，拼接后去除引物区获得扩增片段，检测扩增片段中是否 存在所述分子身份证，如果含有此分子身份证，则证明金银花提取物中渗有杜仲。
[0009] 本发明对于PCR所使用的引物有特别的限制，因杜仲为单属单种，特异性较高，因 此在PCR扩增的过程中为了达到目的条带的准确性，采用专口设计的特异引物。所述PCR扩 增使用的引物为：
[0010] DZF1 5'-GAGTCTTTGAACGCAAGTTG-3'
[0011] DZR1 5'-GACGGCACGGATGCTTAA-3 '
[0012] 上述PCR扩增的反应程序为：
[0013]
[0014] 可选的，所述PCR扩增的反应体系为：
[0015] PCR Buffer(10X)2.扣L，Mg 化化L(25mmol/L)，dNTPs 混合物化L(2.5mmol/L)，引 物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNAl化(-约30ng)，TaqDNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μ L，进行PCR扩增。
[0016] 其中，所述待测样品包括金银花提取物W及主要成分为金银花的中成药品（胶囊， 颗粒)。
【附图说明】
[0017] 图 1 所示为杜仲 E. ulmoides 分子身份证 5 ' -CTAGCGGTGGTCGTACGATAGCCAATGCATGAG T-3'的比对结果。
[0018] 图2所示为金银花提取物的扩增结果：利用特异性引物DZF1/R1在金银花提取物 DNA中扩增出含有杜仲分子身份证片段，样品共12个。通道1-8为山东产的金银花提取物样 品（样品编号JY服1-S8)，通道9，10是西安产的金银花提取物样品（样品编号JY服9-S10)，通 道11，12是长沙产的金银花样品（样品编号1￥服10-511)。
[0019] 图3所示为含金银花的中成药的扩增结果:利用特异性引物DZF1/R1在含有金银花 的中成药的DNA中扩增出含有杜仲分子身份证片段，样品一共5个。通道1，2为小儿咽扁颗粒 (样品编号XEYBP)，通道3,4为双黄连颗粒(样品编号甜LP)，通道5,6为铃羊清肺颗粒(样品 编号LYQFP)，通道7，8为银黄颗粒（样品编号YHP)，通道9,10为茵檐黄软胶囊（样品编号 YZHSC) 〇
[0020] 杜仲序列表中列出的为杜仲化.ulmoides)的分子身份证。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1
[0022] 实施例1用于说明杜仲分子身份证鉴定的真实性
[0023] 1)DNA 的获取
[0024] 从不同产地收集的金银花样品21份，杜仲样品24份。分别取20mg药材，在MM400球 磨仪(德国Retsch)上进行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA试剂盒 提取总DNA。
[00巧]2)PCR扩增
[00%]正向引物DZF1 5'-GAGTCTTTGAACGCAAGTTG-3'
[0027]反向引物DZR1 5' -GACGGCACGGATGCTTAA-3 '
[002引由生工生物工程公司有限公司（北京)合成。引物用无菌去离子溶解并稀释至2.扣 mol/yL。
[0029] 25化反应体系：PCR Bufferα0X)2.5化，Mg2+2化（25mmol/L)，dNTPs混合物化L (2.5mmo 1 /L)，引物各 1.0化（2.5皿01 /L)，模板DNA 1 化（-约 30ng)，Taq DNA聚合酶 1.0U，加 灭菌双蒸水至25化，进行PCR扩增。
[0030] PCR反应程序:在PCR仪上按照W下程序进行扩增反应：
[0031]
[0032] 3)测序
[0033] PCR产物直接送中国农业科学院重大工程实验室测序。测序引物为和。为确保DNA 条形码序列的可靠性，需要进行正反向测序或重复测序，然后将正反向测序结果进行拼接 获得DNA条形码序列。
[0034] 4)序列拼接
[00：3日]本实施例采用应用软件CodonCode Aligner 3.7.1 (CodonCode Co.，Ge;rmany)进 行序列拼接及校对。首先，进行测序质量评估及预处理，即去除测序结果两端的低质量部 分，并对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼接，具体方法是 20bp的窗口分别从序列5'端和3'端进行滑动，如果窗口内有多于2个碱基的Q值小于20，贝。 删除一个碱基，窗口继续滑动，如果窗口内碱基Q值小于20的数目小于或等于2个，窗口停止 滑动。
[0036] 5)同属近缘种序列比对
[0037] 用MEGA 5软件对测序并拼接后的各个样品W及GenBank中杜仲ITS2序列进行比 对，杜仲样品的ITS2序列包含CTAGCGGTGGTCGTACGATAGCCAATGCATGAGT，且杜仲为单属单种， 特异性很高，而包括金银花在内的任何其它物种均不具有此分子身份证(图1)。
[0038] 实施例2金银花提取物中杜仲成分的鉴定
[0039] 采用与实施例1相同的方法进行鉴定，所不同的是W金银花提取物为样品，本次所 选择的样品来自山东庄河、陕西西安、W及湖南长沙。共计12批次，见表1。提取基因组DNA， 应用杜仲特异引物DZF1/DZR1进行扩增（如图2)并测序，在序列中查找杜仲分子身份证。研 究结果表明：10/12份金银花提取物中均检测到了杜仲分子身份证，山东庄河和长沙产的金 银花提取物均渗杂有杜仲;西安2个样品没有扩增到目的片段。说明应用此方法可W判断金 银花提取物中是否渗杂杜仲提取物或叶片。
[0040] 表1金银花提取物采样表
[0041]
[0042] 实施例3W金银花为主要成分中成药品的鉴定
[0043] 采用与实施例1相同的方法进行鉴定，所不同的是W含金银花的中成药(胶囊，颗 粒)为样品，见表2,运些样品在《中华人民共和国药典》中的检测标准都是W绿原酸计。提取 中成药基因组DNA，应用杜仲特异引物DZF1/DZR1进行扩增并测序，在序列中查找杜仲分子 身份证，结果表明小儿咽扁颗粒、双黄连颗粒、铃羊清肺颗粒和银黄颗粒扩增出含有杜仲分 子身份证的片段，目的片段大约为20化p"V5中成药能特异性地检测到杜仲分子身份证，说 明在W绿原酸为金银花含量检测标准的中成药中渗假现象比较严重。
[0044] 表2含金银花中成药取样表
[0045]
[0046] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 杜仲分子身份证，其特征在于，所述分子身份证中含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸 序列。2. 根据权利要求1所述的分子身份证，其特征在于，所述分子身份证为SEQ ID No.1所 示的核苷酸序列。3. -种金银花提取物的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括检测样品基因组DNA中是 否存在权利要求1-2中任意一项所述的分子身份证，如果含有则判断金银花提取物中掺有 杜仲提取物或杜仲叶。4. 根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 1) 以待测样品基因组DNA为模板，对所述分子身份证进行PCR扩增，获得扩增产物； 2) 对扩增产物进行测序，拼接后去除引物区获得扩增片段，检测扩增片段中是否存在 所述分子身份证。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，检测扩增片段中是否存在SEQ ID No.1所 示的核苷酸序列。6. 权利要求1-2所述的分子身份证序列或权利要求3-5中任意一项所述的鉴定方法在 金银花提取物鉴定中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK106011231SQ201610310759
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】韩建萍, 高梓童, 宋经元, 陈士林
【申请人】中国医学科学院药用植物研究所