用于人的18个str位点的复合扩增系统、试剂盒及其用图
【专利摘要】本发明公开了一种用于人的18个STR位点的复合扩增系统、试剂盒及其用途，同时扩增18个基因座：Amel、D5S818、D21S11、D18S1364、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、PentaD、D19S433、D22S1045、Y?GATA?H4、PentaE、D2S441、D12S391、D2S1338和DXS9898，可以一次得到18个基因座信息，具有很高的个体识别率和非父排除率，无论在PCR扩增和遗传分析仪检测环节，都节省了成本和人力，提高了工作效率。特别是，本发明的复合扩增系统相比现有系统更加适合中华民族遗传多态性的位点分析，可以作为中华民族个体识别和亲权鉴定新的参考标准。
【专利说明】
用于人的18个STR位点的复合扩増系统、试剂盒及其用途
技术领域
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及人类基因组中具有多态性的遗传标记基因的 检测技术，特别设及用聚合酶链式反应在一个复合扩增系统中同时扩增18个基因座的系 统、检测试剂盒及其用途。
【背景技术】
[0002] 短串联重复序列（Shod Tandom Repeat，STR)，也称为微卫星，或简单序列重复 (Simple Sequence Repeats，SSR)，是一类广泛存在于人类基因组中的DNA重复序列，核屯、 序列为2-6个碱基重复单位。因其在人类基因组中分布广泛、具有高度的遗传多态性、检测 方法简单而被广泛应用于个体识别、亲权鉴定和群体遗传学研究。
[0003] 目前，STR复合扩增技术已成为法医个体识别和亲权鉴定的主要技术手段，在世界 各地的DNA实验室得到广泛应用。同时也在案件分析中得到广泛应用，为案件侦破提供了有 力证据。随着STR复合扩增技术的快速发展，很多国家利用运一技术建立了犯罪分子及嫌疑 人的DNA数据库，便于进行比对和排查等工作。
[0004] 早期的STR复合扩增技术能够实现在一个反应体系中扩增10个左右的STR基因座， 随着应用的广泛和数据比对的增加，10个基因座提供的信息不能满足要求，国内外的厂家 开发出新的更多基因座的产品，比如美国ABI公司的AmpFlSTR IdentifileH式剂盒和美国 Promega公司的16位点试剂盒都是15个STR基因座加性别决定基因。
[0005] 近年来，随着DNA鉴定手段的应用越来越广，用户对试剂盒的基因座数量、信息含 量和兼容性有了更高的要求。作为在某些遗传鉴定中，需要更多的基因座提供更多的信息 量。比如亲权鉴定、失踪人口比对时，检测的基因座数量过少可能导致误判。为了达到运一 目的，目前的做法通常是选择两种厂家的复合扩增试剂盒作为补充，联合使用，达到17个 STR基因座W上的效果。如果能够实现一次反应扩增18个W上基因座，不仅可W节约试剂成 本，还可W提高工作效率、节省人力成本等。
[0006] 目前国外比较流行的个体识别和亲权鉴定试剂盒主要有A B公司的 Identifile;rTM、Sinofile;rTM、GlobalFile;rTM和P;romega公司的F^owe;rPlexl6和F^owe;rPlex 21;国内有基点认知公司的Golden巧e 20A，阅微基因的MicroReaderTM 21D，中德美联公司 的AGCU E邱ressmarker 22,宁波海尔施基因科技有限公司的STIUyper-21G等。运些试剂盒 均采用4色/5色巧光标记复合扩增体系。
[0007] 然而目前所采用的试剂盒大多W美国的C0DIS标准规定的13个核屯、基因座(vWA、 D21Sll、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D8S1179、D3S1358、CSFlPO、?〇l、 ΤΡΟΧ)为基础，在此基础增加其他基因座。而在13个CODIS基因座中，ΤΡΟΧ和??01两个位点在 中华民族群体中的遗传多态性很低，其中，ΤΡ0Χ在中华民族中主要W8,9和11Ξ个等位基因 为主，其多态性远低于南非人群，TH01则在中华民族中主要W6,7和9Ξ个等位基因为主，并 且ΤΡΟΧ和TH01两个位点的个体识别率(DP)、排除率化P)、杂合度化e似及多态信息量(PIC) 等法医学参数也低于其他位点。018551、〔5。1口0、0851179、￥胖4和。645个位点易出错，易出现 丢失峰的情况，运些位点的突变率高于其他基因座。其中，FGA的突变率为0.25%。并不适合 用于中华民族群体的鉴定。
[0008] 因此，选取一套适合中华民族遗传多态性的位点，建立中华民族个体识别和亲权 鉴定新的参考标准，显得尤为重要。
【发明内容】
[0009] 本发明提供一种检测18个STR基因座的复合扩增系统，包含15个常染色STR、一个 X-STR、一个Y-STR和一个性别鉴定位点Ame 1;本发明还提供相关引物、试剂盒及其用途。
[0010] 根据本发明的第一方面，本发明提供一种同时分析多个STR基因座的复合扩增系 统，该复合扩增系统同时扩增如下18个基因座:Amel、D5S818、D21Sll、D18S1364、D6S1043、 D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、PentaD、D19S433、D22S1045、Y-GATA-H4、PentaE、 D2S441、D12S391、D2S1338和DXS9898。
[0011] 作为本发明的进一步改进的方案，上述基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩 增，其中每对引物中有一个引物的5'端进行巧光素标记。
[0012] 作为本发明的进一步改进的方案，上述复合扩增系统包括如下18对引物：
[OOU] 用于扩增Amel的上游引物如沈Q ID N0:1所示；
[0014] 用于扩增Amel的下游引物如SEQ ID N0:2所示；
[001引用于扩增D5S818的上游引物如沈Q ID N0:3所示；
[0016] 用于扩增D5S818的下游引物如沈Q ID N0:4所示；
[0017] 用于扩增D21S11的上游引物如沈Q ID N0:5所示；
[0018] 用于扩增D21S11的下游引物如沈Q ID N0:6所示；
[0019] 用于扩增D18S1364的上游引物如沈Q ID N0:7所示；
[0020] 用于扩增D18S1364的下游引物如沈Q ID N0:8所示；
[0021] 用于扩增D6S1043的上游引物如沈Q ID N0:9所示；
[0022] 用于扩增0651043的下游引物如沈9 10備:10所示；
[0023] 用于扩增0351358的上游引物如沈9 10備:11所示；
[0024] 用于扩增0351358的下游引物如沈9 10^:12所示；
[0025] 用于扩增0135317的上游引物如沈9 10^:13所示；
[0026] 用于扩增0135317的下游引物如沈9 10備:14所示；
[0027] 用于扩增075820的上游引物如沈9 10備:15所示；
[0028] 用于扩增075820的下游引物如沈9 10備:16所示；
[0029] 用于扩增0165539的上游引物如沈9 10^:17所示；
[0030] 用于扩增0165539的下游引物如沈9 10備:18所示；
[0031] 用于扩增化ntaD的上游引物如沈Q ID NO: 19所示；
[0032] 用于扩增化ntaD的下游引物如沈Q ID N0:20所示；
[0033] 用于扩增D19S433的上游引物如沈Q ID N0:21所示；
[0034] 用于扩增D19S433的下游引物如沈Q ID N0:22所示；
[0035] 用于扩增D22S1045的上游引物如沈Q ID N0:23所示；
[0036] 用于扩增D22S1045的下游引物如沈Q ID N0:24所示；
[0037] 用于扩增Y-GATA-H4的上游引物如沈Q ID N0:25所示；
[003引用于扩增￥-64了4-拟的下游引物如沈9 10備:26所示；
[0039] 用于扩增化ntaE的上游引物如沈Q ID N0:27所示；
[0040] 用于扩增化ntaE的下游引物如沈Q ID N0:28所示；
[0041 ] 用于扩增D2S441的上游引物如沈Q ID N0:29所示；
[0042] 用于扩增D2S441的下游引物如沈Q ID N0:30所示；
[0043] 用于扩增D12S391的上游引物如沈Q ID N0:31所示；
[0044] 用于扩增D12S391的下游引物如沈Q ID N0:32所示；
[0045] 用于扩增D2S1338的上游引物如沈Q ID N0:33所示；
[0046] 用于扩增D2S1338的下游引物如沈Q ID N0:34所示；
[0047] 用于扩增DXS9898的上游引物如沈Q ID N0:35所示；
[004引用于扩增DXS9898的下游引物如沈Q ID N0:36所示。
[0049] 作为本发明的进一步改进的方案，上述基因座分为下述四种组合：第一组包含 Amel、D5S818、D21Sll、D18S1364和 D6S1043;第二组包含 D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539 和PentaD;第Ξ组包含D19S433、D22S1045、Y-GATA-H4和PentaE;第四组包含D2S441、 D12S391、D2S1338和DXS9898;上述四种组合的引物分别由四种不同的巧光素标记。
[0050] 作为本发明的进一步改进的方案，上述四种不同的巧光素分别是蓝色、绿色、黄色 和红色巧光素，上述蓝色巧光素是6'-FAM(6'-簇基巧光素），上述绿色巧光素是皿X(六氯- 6-甲基巧光素），上述黄色巧光素是TAMRA(4-甲基-6-簇基-罗丹明），上述红色巧光素是R0X (簇基-X-罗丹明）。
[0051] 作为本发明的进一步改进的方案，在一个复合扩增反应体系中同时扩增上述18个 基因座；上述复合扩增反应体系中，用于扩增如下18个基因座Amel、D5S818、D21Sll、 D18S1364、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、PentaD、D19S433、D22S1045、Y- GATA-H4、Pen化E、D2S441、D12S391、D2S1338和 DXS9898 的引物的终浓度依次分别是：0.0扣 Μ，0.08μΜ，0.18μΜ，0.13μΜ，0.25μΜ，0.07μΜ，0.09μΜ，0.18μΜ，0.08μΜ，0.35μΜ，0.08μΜ，0.1化 Μ，0.21μΜ，0.88μΜ，0.25μΜ，0.20μΜ，0.40μΜ，0.20μΜ。
[0052] 根据本发明的第二方面，本发明提供一种同时分析DM样品中多个STR基因座的方 法，该方法应用第一方面的复合扩增系统检测DNA。
[0053] 根据本发明的第Ξ方面，本发明提供一组用于第一方面的复合扩增系统的引物， 包括沈Q ID N0:1至沈Q ID N0:36所示的18对引物。
[0054] 根据本发明的第四方面，本发明提供一种用于同时分析多个STR基因座的试剂盒， 上述基因座为 Amel、D5S818、D21Sll、D18S1364、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、 D16S539、PentaD、D19S433、D22S1045、Y-GATA-H4、PentaE、D2S441、D12S391、D2S1338和 DXS9898，上述试剂盒包含第Ξ方面的引物。
[0055] 根据本发明的第五方面，本发明提供第一方面的复合扩增系统、第Ξ方面的引物 或第四方面的试剂盒在遗传多态性的位点分析、个体识别和/或亲权鉴定中的用途。也就是 说，本发明提供第一方面的复合扩增系统在遗传多态性的位点分析、个体识别和/或亲权鉴 定中的用途;还提供第Ξ方面的引物在遗传多态性的位点分析、个体识别和/或亲权鉴定中 的用途;又提供第四方面的试剂盒在遗传多态性的位点分析、个体识别和/或亲权鉴定中的 用途。
[0056] 随着复合基因座数目的增加，由于竞争的影响，各基因座的相对平衡控制难度加 大，本发明通过多次实验，建立了一次检测18个基因座的复合扩增系统，运些STR基因座包 含了 C0DIS 系统中 055818、021511、0351358、0135317、075820和0165539共6个在中华民族中 多态性和稳定性较好的位点，W及化nta D、Penta E、D2S1338、D12S391和D19S433共5个欧 洲标准位点，并新增了D18S1364、D2S441和D22S1045共3个中华民族多态性高的非C0DIS位 点W及性染色体STR基因座DXS9898和Y-GATA-H4辅助性别鉴定。利用本发明的复合扩增系 统可W-次性检测18个基因座，得到18个基因座信息，因此运一系统具有很高的个体识别 率和非父排除率，无论在PCR扩增和遗传分析仪检测环节，都节省了成本和人力，提高了工 作效率。特别是，本发明的复合扩增系统相比现有系统更加适合中华民族遗传多态性的位 点分析，可W作为中华民族个体识别和亲权鉴定新的参考标准。
【附图说明】
[0057] 图1为本发明的18个STR基因座在人类基因组中的定位示意图；
[0化引图2为本发明中D19S433、D6S1043和化ntaE共3个STR基因座的引物筛选电泳胶图；
[0059] 图3、图4和图5是本发明一个实施例中复合扩增体系建立和优化过程中的一些分 型结果图；其中，图3中D19S433、D12S391扩增出现多个杂峰；图3和图4中由于引物比例不当 (引物比例见表7)，导致多个位点未检出；图5中D18S1364明显优势扩增，D2S441则扩增十分 微弱；
[0060] 图6、图7和图8是本发明一个实施例中用GeneMapperlDx软件分析实验数据得到的 图谱和分型结果，其中图6是一男性样本的分型结果；图7是一女性样本的分型结果；图8是 等位基因阶梯分型结果。
【具体实施方式】
[0061 ]下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0062] 本发明建立了一种检测18个STR基因座的复合扩增系统，包含15个常染色STR、一 个X-STR、一个Y-STR和一个性别鉴定位点Amel。本发明的18个STR基因座具体为Amel、 D5S818、D21Sll、D18S1364、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、Pen^D、D19S433、 02251045、￥-64了4寸4、口6111曰6、025441、0125391、0251338和0乂59898。运18个基因座在基因 组中的定位如图1所示。
[0063] 本发明的复合扩增系统具体可W是复合扩增体系，运样的复合扩增体系可W包含 引物混合物、反应缓冲液和热启动化q DNA聚合酶等。
[0064] 首先针对上述18个基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性引物。引物设计采 用PrimerPrimie巧和01igo7软件，每条引物退火溫度接近或高于60°C。不能产生引物二聚 体或者错配引起的其它非特异性产物，扩增产物长度在90-450bp之间。并用Blast对每对引 物进行比对，保证序列的特异性。对每对引物进行PCR扩增测试，琼脂糖凝胶电泳检测并反 复优化，直至得到清晰单一扩增条带（具体见实施例1)。本发明得到了一组优化的引物序 列，见下表1。
[0065] 表1复合扩增各基因座的引物序列
[0066]
[0067]
[006引根据扩增片段长度等将上述基因座分为4组，第一组包含Amel、D5S818、D21Sll、 D18S1364和 D6S1043,第二组包含0351358、0135317、075820、0165539和化111曰0，第^组包含 D19S433、D22S1045、Y-GATA-H4 和化 ntaE，第四组包含 D2S441、D12S391、D2S1338和 DXS9898。 每组分别由不同巧光素标记，每组之中各基因座扩增产物根据长度差异分开，相邻两个基 因座不能有重叠。其中每个位点的扩增长度范围如表2所示。分别对每组引物进行复合扩增 试验，确定该组没有非特异扩增现象，无交叉反应等情况后，反复调整每对引物的浓度(PCR 终浓度见表1)，使组内各个片段峰值均衡性达到40% W上。
[0069] 表2各基因座的扩增片段范围
[0070]
[0071] 将4组引物分别用蓝色、绿色、黄色和红色巧光素标记。每对引物中只标记一条链， 标记在引物的5'端。蓝色用6'-FAM(6'-簇基巧光素)标记，绿色用肥X(六氯-6-甲基巧光素） 标记，黄色用TAMRA(4-甲基-6-簇基-罗丹明）标记，红色用R0X(簇基-X-罗丹明）标记。将4组 18个基因座复合扩增，根据产物峰高情况调整各基因座引物浓度，使各基因座峰值整体均 衡性达到30% W上。得到的引物混合物可W用于上述18个基因座复合扩增。
[0072] 本发明的PCR扩增反应可在一定的缓冲体系中进行。缓冲体系中包括:50mM KC1， lOmM Tris-肥 1(抑 8.3,25°C)，2.0mM MgCl2,0.1mg/ml BSA(牛血清白蛋白）和各0.2mM的 dNTPMix。dNTPMix是四种脱氧核糖核巧酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)等摩尔混合物。
[0073] 反应所需的化q DNA聚合酶为热启动DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰的都可 W。本发明的每个扩增体系(2化L)需要1U至2U的化q DNA聚合酶。
[0074] 扩增体系在各种反应热循环仪上（如ABI 9700、ABI Ve;riti、Bi〇-Rad my切cler 等)采用表3的溫度循环条件可W得到较好的结果。
[0075] 表3复合扩增体系溫度循环条件
[0076]
[0077] 本发明中的模板DM为人类基因组DM。由各种常规方法，比如磁珠法、酪氯仿法、 树脂纯化等方法提取的模板DNA均可W得到较好的结果。DNA可W由W下组织或细胞制备： 血液(血斑）、精液(精斑）、骨骼、毛发、唾液(唾液斑）、汗液、含有胎儿细胞的羊水等。DNA模 板量优选在0. 〇5ng至5ng的范围内能够得到较好的扩增结果，模板量太低可能导致某些基 因座位检测不出，模板量太高会导致非特异性的扩增产物产生。
[0078] 在上述反应缓冲体系中按照指定的反应程序扩增模板DNA，可W得到各基因座混 合的扩增产物。本发明由于采用了巧光标记的引物，扩增产物也带有巧光标记物，并且标记 物可W在激光激发下发出可W通过遗传分析仪(如ABI3130、3100、3500等)识别的光信号， 所W扩增产物可W通过测序仪或遗传分析仪等仪器上进行电泳和检测分析。
[0079] 在测序仪或遗传分析仪上进行检测的时候，扩增产物与分子量内标、去离子甲酯 胺按照一定比例混合，进入仪器毛细管或凝胶中电泳分离。分子量内标是由多条已知长度 的巧光标记DNA片段组成，用来计算PCR扩增产物片段长度，从而可W判断基因分型W及与 等位基因阶梯比对。
[0080] 电泳后的数据可W在GeneMappe;rIDx、GeneMarke;r等数据分析软件上分析，得到 STR基因分型图谱和数据。
[0081] 下面通过具体案例的方式进一步说明本发明。下面的案例仅仅是为了说明的目 的，而并非限制本发明的范围。
[0082] 实施例1引物的初筛
[0083] 本发明所用的引物在上海invi化ogen公司合成，引物初筛采用PCR扩增-琼脂糖凝 胶电泳的方法进行。所用化q酶为热启动化q酶，血液由志愿者贡献，DNA采用chelex-100法 提取。反应体系如表4所示，溫度循环条件如表5所示。所有引物采用primer primie巧和 〇lig〇7软件进行设计，每个位点设计2-8对引物备选。
[0084] 1.1.chelex-100方法提取DNA(具体方法参考《Forensic DNA Protocol》，Humana Press,1998)〇
[00化]1)取化L加抗凝剂的血液于1.5ml离屯、管中；
[0086] 2)振荡混匀chelex溶液，使chelex充分悬浮，每管加200μΙ 5%的chelex-100 (100-200mesh，购自 Bio-Rad 公司）；
[0087] 3)振荡样品，恒溫金属浴上56°C溫浴2小时后，取出样品振荡2分钟；
[008引 4)煮沸8-10分钟，13000巧m离屯、3分钟；
[0089] 5)小屯、吸出约15化L上清，转移至新的1.5ml离屯、管中。
[0090] 1.2聚合酶链式反应(PCR)扩增
[0091] 1)取缓冲液、模板DNA、Taq酶、无核酸水按照表4配成混合液，振荡混匀后分装至 PCR反应管中，每管20yL，加入个位点的引物。
[0092] 表4引物筛选反应体系 Γ00931
[0094] 2)按照表5的反应条件设置热循环仪增仪(ABI VeritiPCR仪），将PCR反应管放入 仪器中进行PCR扩增。[0095] 表5引物筛选PCR溫度循环条件
[0096]
[0097]
[0098] 1.3琼脂糖凝胶电泳
[0099] 1)配制3%的琼脂糖凝胶电泳；
[0100] 2)PCR产物按照1:5加入4yL6 X上样染料（loadin曲ye)，上样10化，DNA Marker采 用50bp ladder,上样化1^;
[0101] 3)设定电压 120V，电泳 40min;
[0102] 4化B染色5min，凝胶成像仪拍摄电泳胶图。
[0103] 其中，D19S433、D6S1043和化nt址基因座的电泳胶图如图2所示。在筛选过程中，尤 其是D19S433,前后共设计8对引物，才筛选到了条带单一清晰的引物。
[0104] 实施例2复合扩增体系的建立
[0105] 血液由志愿者贡献，DNA采用chelex-100法提取。巧光标记引物在上海invihogen 公司合成。引物混合物按照一定比例混合并根据毛细管电泳结果不断调整比例，至各位点 扩增均一稳定。
[0106] 2.1.chelex-100 方法提取 DNA
[0107] 1)取化L加抗凝剂的血液于1.5ml离屯、管中；
[0108] 2)振荡混匀chelex溶液，使chelex充分悬浮，每管加200μΙ 5%的chelex-100 (100-200mesh，购自 Bio-Rad 公司）；
[0109] 3)振荡样品，恒溫金属浴上56°C溫浴2小时后，取出样品振荡2分钟；
[0110] 4)煮沸8-10分钟，13000巧m离屯、3分钟；
[0111] 5)小屯、吸出约150化上清，转移至新的1.5ml离屯、管中。
[0112] 2.2.引物混合物配置
[0113] 1)将引物干粉中加入定量灭菌超纯水，配成50μΜ母液；
[0114] 2)将18个位点的36条引物按比例混合，同一位点的引物等量加入，引物比例和浓 度通过毛细管电泳检测结果不断调整。
[0115] 2.3聚合酶链式反应(PCR)扩增
[0116] 1)取缓冲液、引物混合物、Taq酶，按照表6配成混合液，振荡混匀后分装至PCR反应
[0119] 2)按照表3的反应条件设置热循环仪增仪(ABI VeritiPCR仪），将PCR反应管放入 仪器中进行PCR扩增。
[0120] 2.3.扩增反应结束后，取出反应管，用ABI 3500遗传分析仪进行电泳和检测
[0121] 1)取(0.2扣L分子量内标化IZ-500)+9.25化去离子甲酯胺）X(样品数)配成混合 液；
[0122] 2)混匀后分装至96孔板，每管9.扣L，再分别加入0.扣L扩增产物，简短离屯、将液体 收集到管子底部；
[0123] 3)样品95°C变性3分钟，然后迅速冰上冷却4分钟，使DNA完全变性并且保持变性状 态(运一步变性可选，甲酯胺本身可W使DNA变性）；
[0124] 4)将样品放入基因分析仪的样品托盘中，设置仪器参数(进样电压3kV，进样时间 10秒钟），开始电泳检测，电压15kV，炉溫60 °C ;
[0125] 5)大约37分钟后，电泳结束，用GeneMapperlDx软件分析实验数据，观察各位点的 扩增情况，观察是否有杂峰，更换个别位点的引物，不断调整引物比例，建立均一稳定的复 合扩增体系。
[0126] 其中，图3、图4和图5是在复合扩增体系建立和优化过程中的一些分型结果。图3中 D19S433、D12S391扩增出现多个杂峰，图3和图4中由于引物比例不当（引物比例见表7)，导 致多个位点未检出。图5中D18S1364明显优势扩增，D2S441则扩增十分微弱。
[0127] 在实施过程中，为解决上述问题，修改了D19S433和D12S391的引物，修改前后的序 列见表8。
[0128] 表7实施例2对应的引物比例及浓度
[0129]
[0130]
[0131]表8部分位点替换前后的引物序列
[0132][0133]
[0134]实施例3复合扩增两个样本(男性1例，女性1例）18个基因座并分析其基因型 [01巧]血液由志愿者捐献。模板DNA由血液中用chelex-100方法提取。扩增反应在ABI VeritiPCR仪上进行，电泳及检测在ABI 3500遗传分析仪上进行，数据分析采用GeneMapper ID X软件。本发明所用的试剂和材料诸如等位基因 ladder均为本领域技术人员常用的常规 材料。
[0136] 3.1.chelex-100 方法提取 DNA
[0137] 1)取化L加抗凝剂的血液于1.5ml离屯、管中；
[0138] 2)振荡混匀chelex溶液，使chelex充分悬浮，每管加200μΙ 5%的chelex-100 (100-200mesh，购自Bio-Rad公司）；
[0139] 3)振荡样品，恒溫金属浴上56°C溫浴2小时后，取出样品振荡2分钟；
[0140] 4)煮沸8-10分钟，13000巧m离屯、3分钟；
[0141] 5)小屯、吸出约150化上清，转移至新的1.5ml离屯、管中。
[0142] 3.2.聚合酶链式反应(PCR)扩增
[0143] 1)取缓冲液、引物混合物、Taq酶，按照表6配成混合液，振荡混匀后分装至PCR反应 管中，每管25化，加入模板DNA。反应体系中，各引物的终浓度如表1所示。
[0144] 2)按照表3的反应条件设置热循环仪增仪(ABI VeritiPCR仪），将PCR反应管放入 仪器中进行PCR扩增。
[0145] 3.3.扩增反应结束后，取出反应管，用ABI 3500遗传分析仪进行电泳和检测
[0146] 1)取(0.2扣L分子量内标化IZ-500)+9.25化去离子甲酯胺）X(样品数)配成混合 液；
[0147] 2)混匀后分装至96孔板，每管9.5yL，再分别加入(KSiiL扩增产物和等位基因 ladder标准物，简短离屯、将液体收集到管子底部；
[014引 3)样品95°C变性3分钟，然后迅速冰上冷却4分钟，使DNA完全变性并且保持变性状 态；
[0149] 4)将样品放入基因分析仪的样品托盘中，设置仪器参数(进样电压3kV，进样时间 10秒钟），开始电泳检测，电压15kV，炉溫60 °C ;
[0150] 5)大约37分钟后，电泳结束，用GeneMapperlDx软件分析实验数据得到图谱和分型 结果，如图6、图7和图8及表9所示。
[0151] 表9实施例3的检测结果
[0152]
[0153] 实施例4复合扩增两个样本(父亲和女儿，已由基点认知Goldeneye 20A证明是亲 生父女关系）18个基因座并分析其基因型
[0154] 血液由志愿者捐献。模板DNA由血液中用chelex-100方法提取。扩增反应在ABI 9700热循环仪上进行，电泳及检测在ABI 3500遗传分析仪上进行，数据分析采用 GeneMapperlDx软件。本发明所用的试剂和材料诸如等位基因 ladder均为本领域技术人员 常用的常规材料。
[0155] 4.1.chelex-100 方法提取 DNA
[0156] 1)取化L加抗凝剂的血液于1.5ml离屯、管中；
[0157] 2)振荡混匀chelex溶液，使chelex充分悬浮，每管加200μΙ 5%的chelex-100 (100-200mesh，购自 Bio-Rad 公司）；
[015引3)振荡样品，恒溫金属浴上56°C溫浴2小时后，取出样品振荡2分钟；
[0159] 4)煮沸8-10分钟，13000巧m离屯、3分钟；
[0160] 5)小屯、吸出约15化L上清，转移至新管中，1化L PCR反应体系取化L作为模板。
[0161] 4.2.聚合酶链式反应(PCR)扩增
[0162] 1)取缓冲液、引物混合物、Taq酶，按照表6配成混合液，振荡混匀后分装至PCR反应 管中，每管25化，加入模板DNA。反应体系中，各引物的终浓度如表1所示。
[0163] 2)按照表3的反应条件设置热循环仪增仪(ABI VeritiPCR仪），将PCR反应管放入 仪器中开始扩增基因片段。
[0164] 4.3.扩增反应结束后，取出反应管，用ABI 3500遗传分析仪进行电泳和检测
[0165] 1)取(0.2扣L分子量内标化IZ-500)+9.25化去离子甲酯胺）X(样品数)配成混合 液；
[0166] 2)混匀后分装，每管9.扣L，再分别加入0.扣L扩增产物和等位基因 ladder标准物， 简短离屯、将液体收集到离屯、管管子底部；
[0167] 3)样品95°C变性3分钟，然后迅速冰上冷却4分钟，使DNA完全变性并且保持变性状 态(运一步变性可选，甲酯胺本身可W使DNA变性）；
[0168] 4)将样品放入基因分析仪的样品托盘中，设置仪器参数(进样电压3kV，进样时间 15秒钟），开始电泳检测，电压15kV，炉溫60°C。
[0169] 5)大约37分钟后，电泳结束，用GeneMapperlDx软件分析实验数据得到图谱和分型 结果(表10)。
[0170] 表10实施例4的分型结果
[0171]
[0172]
[0173] 表10的分型数据显示，父亲和女儿未出现任何矛盾基因座，与Goldeneye20A鉴定 结果一致(表11)。
[0174] 表11利用Goldeneye 20A获得的实施例4的分型结果
[0175][0176]
[0177]随着复合基因座数目的增加，由于竞争的影响，各基因座的相对平衡控制难度加 大，本发明通过多次实验，建立了一次检测18个基因座的复合扩增系统，运些STR基因座包 含了 C0DIS 系统中 055818、021511、0351358、0135317、075820和0165539共6个在中华民族中 多态性和稳定性较好的位点，W及化nta D、Penta E、D2S1338、D12S391和D19S433共5个欧 洲标准位点，并新增了D18S1364、D2S441和D22S1045共3个中华民族多态性高的非C0DIS位 点W及性染色体STR基因座DXS9898和Y-GATA-H4辅助性别鉴定。
[017引利用本发明的复合扩增系统可W-次性检测18个基因座，Amel、D5S818、D21Sll、 D18S1364、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、PentaD、D19S433、D22S1045、Y- GATA-H4、Pen 化6、025441、0125391、0251338和0乂59898。
[0179]利用运个扩增体系可W-次操作得到18个基因座信息，因此运一系统具有很高的 个体识别率和非父排除率，无论在PCR扩增和遗传分析仪检测环节，都节省了成本和人力， 提高了工作效率。特别是，本发明的复合扩增系统相比现有系统更加适合中华民族遗传多 态性的位点分析，可W作为中华民族个体识别和亲权鉴定新的参考标准。
[0180] W上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于运些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可W做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护 范围。
【主权项】
1. 一种同时分析多个STR基因座的复合扩增系统，其特征在于，所述复合扩增系统同时 扩增如下 18 个基因座：Amel、D5S818、D21Sll、D18S1364、D6S1043、D3S1358、D13S317、 D7S820、D16S539、PentaD、D19S433、D22S1045、Y-GATA-H4、PentaE、D2S441、D12S391、 D2S1338和DXS9898。2. 根据权利要求1所述的复合扩增系统，其特征在于，所述基因座被位于该基因座两侧 的一对引物扩增，其中每对引物中有一个引物的5'端进行荧光素标记。3. 根据权利要求1或2所述的复合扩增系统，其特征在于，所述复合扩增系统包括如下 18对引物： 用于扩增Amel的上游引物如SEQ ID N0:1所示； 用于扩增Amel的下游引物如SEQ ID N0:2所示； 用于扩增D5S818的上游引物如SEQ ID NO:3所示； 用于扩增D5S818的下游引物如SEQ ID N0:4所示； 用于扩增D21S11的上游引物如SEQ ID N0:5所示； 用于扩增D21S11的下游引物如SEQ ID N0:6所示； 用于扩增D18S1364的上游引物如SEQIDN0:7所示； 用于扩增D18S1364的下游引物如SEQ ID N0:8所示； 用于扩增D6S1043的上游引物如SEQ ID NO:9所示； 用于扩增D6S1043的下游引物如SEQ ID NO: 10所示； 用于扩增D3S1358的上游引物如SEQ ID NO:11所示； 用于扩增D3S1358的下游引物如SEQ ID NO: 12所示； 用于扩增D13S317的上游引物如SEQ ID NO: 13所示； 用于扩增D13S317的下游引物如SEQ ID NO: 14所示； 用于扩增D7S820的上游引物如SEQ ID NO: 15所示； 用于扩增D7S820的下游引物如SEQ ID NO: 16所示； 用于扩增D16S539的上游引物如SEQ ID NO: 17所示； 用于扩增D16S539的下游引物如SEQ ID NO: 18所示； 用于扩增PentaD的上游引物如SEQ ID NO: 19所示； 用于扩增PentaD的下游引物如SEQ ID N0:20所示； 用于扩增D19S433的上游引物如SEQ ID N0:21所示； 用于扩增D19S433的下游引物如SEQ ID N0:22所示； 用于扩增D22S1045的上游引物如SEQIDN0:23所示； 用于扩增D22S1045的下游引物如SEQ ID N0:24所示； 用于扩增Y-GATA-H4的上游引物如SEQIDN0:25所示； 用于扩增Y-GATA-H4的下游引物如SEQ ID N0:26所示； 用于扩增PentaE的上游引物如SEQ ID NO:27所示； 用于扩增PentaE的下游引物如SEQ ID N0:28所示； 用于扩增D2S441的上游引物如SEQ ID NO:29所示； 用于扩增D2S441的下游引物如SEQ ID N0:30所示； 用于扩增D12S391的上游引物如SEQ ID N0:31所示； 用于扩增D12S391的下游引物如SEQ ID N0:32所示； 用于扩增D2S1338的上游引物如SEQIDN0:33所示； 用于扩增D2S1338的下游引物如SEQ ID N0:34所示； 用于扩增DXS9898的上游引物如SEQ ID NO:35所示； 用于扩增DXS9898的下游引物如SEQ ID N0:36所示。4. 根据权利要求1或2所述的复合扩增系统，其特征在于，所述基因座分为下述四种组 合：第一组包含 41^1、055818、021511、01851364和0651043;第二组包含0351358、0135317、 D7S820、D16S539 和 PentaD;第三组包含 D19S433、D22S1045、Y-GATA-H4 和 PentaE;第四组包 含D2S441、D12S391、D2S1338和DXS9898;所述四种组合的引物分别由四种不同的荧光素标 记。5. 根据权利要求4所述的复合扩增系统，其特征在于，所述四种不同的荧光素分别是蓝 色、绿色、黄色和红色荧光素，所述蓝色荧光素是6 ' -FAM(6 羧基荧光素），所述绿色荧光素 是HEX(六氯-6-甲基荧光素），所述黄色荧光素是TAMRA(4-甲基-6-羧基-罗丹明），所述红色 荧光素是R0X(羧基-X-罗丹明）。6. 根据权利要求3所述的复合扩增系统，其特征在于，在一个复合扩增反应体系中同时 扩增所述18个基因座； 所述复合扩增反应体系中，用于扩增如下18个基因座Amel、D5S818、D21Sll、D18S1364、 D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、PentaD、D19S433、D22S1045、Y-GATA-H4、 PentaE、D2S441、D12S391、D2S1338 和 DXS9898 的引物的终浓度依次分别是：0 · 05μΜ，0 · 08μΜ， 0·18μΜ，0.13μΜ，0·25μΜ，0·07μΜ，0·09μΜ，0·18μΜ，0·08μΜ，0·35μΜ，0·08μΜ，0.15μΜ，0·21μΜ， 0.88μΜ，0.25μΜ，0.20μΜ，0.40μΜ，0.20μΜ。7. -种同时分析DNA样品中多个STR基因座的方法，其特征在于，所述方法应用权利要 求1-6任一项所述的复合扩增系统检测DNA。8. -组用于权利要求1-6任一项所述的复合扩增系统的引物，其特征在于，所述引物 包括SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:36所示的18对引物。9. 一种用于同时分析多个STR基因座的试剂盒，其特征在于，所述基因座为Amel、 D5S818、D21Sll、D18S1364、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、PentaD、D19S433、 D22S1045、Y-GATA-H4、PentaE、D2S441、D12S391、D2S1338 和 DXS9898，所述试剂盒包含权利 要求8所述的引物。10. 权利要求1-6任一项所述的复合扩增系统、权利要求8所述的引物或权利要求9所述 的试剂盒在遗传多态性的位点分析、个体识别和/或亲权鉴定中的用途。
【文档编号】C12Q1/68GK106011229SQ201610264861
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】李生斌, 伏东科, 李波, 王泳钦, 曾柳眉, 何芳
【申请人】深圳华大法医科技有限公司