等温核酸扩增反应试剂及等温核酸扩增方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体而言，本发明设及一种灵敏度高的可在等溫下 实现快速扩增的等溫核酸扩增反应试剂和等溫核酸扩增方法。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应(PCR)技术自1983年由Mullis等发明W来，在生命科学研究等方 面得到广泛应用。传统的PCR反应中，在存在DNA模板、引物、四种dTTP、适当的缓冲液的反应 混合物的条件下，通过DNA聚合酶催化从而对目的DNA片段进行扩增。PCR反应一般包括变 性、退火和延伸Ξ个步骤，每个步骤重复30至40次，由此对少量目的DNA片段进行指数级扩 增已达到可W检测的水平。由于PCR技术可将少量核酸分子进行扩增达到仪器可检测的水 平，因此迅速应用于多个领域，例如，疾病诊断、动植物病理学研究、微生物检测等等。
[0003] 基于PCR的强大的扩增能力，在实际应用中，将PCR与其它分子生物学方法W及免 疫学方法等相结合发展得到了多种检测技术，例如巧光定量PCR技术、多重PCR检测技术等 已在疾病检测方面得到广泛使用。
[0004] 然而，出于热循环过程中溫度变化和特定溫度条件要求，传统PCR技术要求仪器必 须具备精细的溫度控制程序，能够在预定时间准确地升降溫度，从而实现溫度的循环变化， 运大大增加了仪器研制成本，使仪器价格昂贵，并且由于溫度的变化和维持完全依赖于电 源，因此电力消耗非常大。目前已经研发出多种等溫体外核酸扩增技术，如TMA技术(转录介 导的核酸扩增技术）、SDA技术(链置换核酸扩增技术）、LAMP肺介导核酸扩增技术）、HDA(解 旋酶依赖等溫核酸扩增技术)等等，运些技术在恒定的溫度(60至65度)下就可W实现高效 的核酸扩增，从而使无需使用对溫度进行精准控制的PCR仪。然而运些技术需要的溫度仍然 较高，如果能实现在更低溫度下进行等溫核酸扩增，则将使核酸扩增技术变得更加节能和 简单易行，并进一步扩大核酸扩增技术的应用范围。
【发明内容】
[000引针对传统PCR技术的缺陷，本发明的发明人在研究中发现天蓝色链霉菌recA蛋白 可在常溫条件下与单链DNA结合，在T4隧菌体DNA解旋酶gp41蛋白打开DNA双链的前提下，将 结合的单链DNA与同源互补区域进行置换作用，在单链结合蛋白和DNA聚合酶的存在下进行 链的延伸反应，从而在恒溫等溫条件下实现特定核酸序列的指数扩增，该核酸扩增过程可 降低对体外核酸扩增仪器的要求，使得核酸扩增过程在常溫等溫条件下即可实现，不需要 传统PCR扩增的机械式升溫降溫过程。
[0006] -方面，本发明提供一种等溫核酸扩增试剂，所述等溫核酸扩增试剂包括： Tris-HCl缓冲液 100-800 mM 氯化?钢 10-150 mM 氯化钟 10-150 mM 氯化镇 10-50 mM 二硫苏糖醇 5-15 mM 聚乙娇化咯烧醜 5-20% ATP 10-20 mM dNPTs 1-5 mM
[0007] 鱗酸蹄醇丙禍酸 10-50 mM 丙固同酸激酶 500-1500 ng/μL BSA 100-500 ng/μL 引物组 每种引物25-200 pmol T4途菌体DNA解旋酶gp41蛋白 50-200 ng/μL 天蓝色链霉菌recA蛋白 100-500 ng/μL 单链结合蛋白 200-1000 ng/μL 大肠杆菌DNA聚合酶I 50-200 ng/yL
[0008] 本发明的等溫核酸扩增反应，是指在恒定的溫度下进行核酸扩增。优选地，本发明 的等溫核酸扩增反应试剂的反应溫度为20°C至42°C。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述试剂中的化is-HCl缓冲液的抑为8.0,聚乙締化 咯烧酬(PVP)的分子量为40000-1200000，优选为360000。
[0010] 在本发明的另一实施方式中，所述引物组包括至少两种引物。
[0011] 在本发明的又一实施方式中，所述反应试剂还包括巧光染料。所述巧光染料为 SYBRGREEN USYT0-13或者SYT0-82。
[0012] 另一方面，本发明提供一种等溫核酸扩增方法，所述方法包括W下步骤：（1)提供 DNA或cDNA模板；（2)加入本发明的等溫核酸扩增反应试剂，在20°C至42°C下反应15分钟至 50分钟，完成核酸扩增。其中，所述等溫核酸扩增反应试剂中的引物组根据步骤(1)中的DNA 或cDNA模板设计得到。
[0013] 本发明试剂中的引物，是指可用于特异性扩增目标核酸的寡核巧酸链，长度为28- 36个碱基之间，引物序列不形成二级结构区、回文序列W及连续的重复碱基序列；引物的化 值不作为设计主要素。
[0014] 本发明试剂中的四种酶蛋白：隧菌体DNA解旋酶即41蛋白、天蓝色链霉菌recA蛋 白、单链结合蛋白和大肠杆菌DNA聚合酶I在扩增反应的过程中行使不同功能，缺一不可，通 过运些酶蛋白的相互作用在等溫条件下实现核酸的快速体外扩增。
[0015] 本发明提供的等溫核酸扩增反应试剂及等溫核酸扩增方法可在20°C至42°C的较 低恒定溫度下对核酸进行等溫扩增;通过设计多组引物，可同时进行多重核酸扩增;本发明 的链置换反应系统还可W包含巧光染料，所述的巧光染料可W是SYBRGREEN USYT0-13或 者SYT0-82,可W根据巧光直接判读扩增结果，实现在非实验室环境下的核酸扩增检测及其 结果判读。由此可见，通过本发明提供的等溫核酸扩增反应试剂和等溫核酸扩增方法进行 核酸扩增在很大程度上降低了对仪器W及技术的要求，大大简化了核酸扩增反应过程。
【附图说明】
[0016] 图1为实施例1中等溫核酸扩增产物的检测结果，泳道1显示W样本1为模板的核酸 扩增产物，泳道2显示W样本2为模板的核酸扩增产物。
[0017] 图2为实施例2中等溫核酸扩增产物的检测结果，泳道1显示W样本3为模板的核酸 扩增产物。
[0018] 图3为实施例3中等溫核酸扩增产物的检测结果，泳道1显示W样本4为模板的核酸 扩增产物，泳道2显示W样本5为模板的核酸扩增产物，泳道3显示W样本6为模板的核酸扩 增产物，泳道4和5分别显示W样本4和样本6为模板的二重核酸扩增产物，泳道6和7分别显 示W样本4、样本5和样本6为模板的Ξ重核酸扩增产物。
【具体实施方式】
[0019] 下面将结合具体的实施例对本发明作进一步详细说明，W下实施例仅仅是为了举 例说明，对发明不构成任何限定。
[0020] 除非另有说明，本发明采用的分子生物学、基因工程等生物学领域的常规技术，运 些技术在本领域技术人员所理解的范围之内。
[0021] 实施例1转基因玉米N0S终止子的基因扩增
[0022] 转基因玉米含有N0S终止子，而野生型玉米则没有该基因序列，因此，可W通过对 该序列进行扩增来鉴别转基因玉米。在本实施例中，通过采用本发明提供的等溫扩增试剂 和方法来对转基因玉米的N0S终止子进行检测。
[0023] (1)引物设计
[0024] 选择玉米N0S终止子的全序列提交至美国国家生物中屯、网站上的数据库化ttp://WWW.ncbi .nlm.n:ih. gov/)进行Blast检索，通过网站Blast程序分析寻找NOS终止子和玉米 的基因组序列没有高同源性的DNA片段。根据Blast结果在N0S终止子中选取了一段253bp的 序列（SEQ ID No. 1)进行引物设计。
[002引 模板序列（SEQ ID No.l):
[0026] cgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttct gttg曰曰tt曰cgtt曰曰gc曰tgt曰曰t曰曰tt曰曰c曰tgt曰曰tgc曰tg曰cgtt曰ttt曰tg曰g曰tgggttttt曰tg曰tt曰g曰g tcccgc曰曰tt曰t曰c曰ttt曰曰t曰cgcg曰t曰g曰曰曰曰c曰曰曰曰t曰t曰gcgcgc曰曰曰ct曰gg曰t曰曰曰tt曰tcgcgcgcggtg tcatctatgttactagatcggg [0027]引物；
[0028] 正向引物5'gattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatc 3'沈Q ID N0:2
[0029] 反向引物5'gtttgcgcgctatattttgttttctatcgcgta 3'沈Q ID N0:3
[0030] (2)玉米基因组DM的提取
[0031] 在通风楓中，使用植物基因组DM提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司，步骤 严格按照试剂盒说明书进行)对转基因玉米样本提取高纯度DNA，得到DNA样本50μ1，标记为 样本1;及非转基因玉米样本提取的DNA样本50μ1标记为样本2。
[0032] (3)核酸扩增及检测
[0033] 从样本1和样本2中各取出化1到一个新的20化1的PCR管中，再加入49μ1等溫核酸 扩增链替换反应试剂(保存于-20°C冰箱），其成分如下： Tris-HCl缓冲液（p'H 8.0) 200 mM 氯化铜 80 mM 氯化钟 70 mM 氯化緩 20 mM 二瑞苏糖醇 8 mM 聚乙締化咯烧綱40000 10% ATP 12 mM dNPTs 4 mM
[0034] 礎酸蛛醇丙禍酸 20 mM 巧固同酸激晦 800ng/Ml 引物A ( SEQ ID NO:5 ) 25 pmol 引物B ( SEQ ID NO:6 ) 25 pmol T4唾菌体DNA解旋酶gp41蛋白 80 ng/μL 天蓝色链霉菌recA蛋白 200η§/μ1 单链结合蛋白 SOOng/ul 大肠杆菌DNA聚合酶I 120 ng/ μ 1
[003引将PCR管放入37°C等溫金属浴解育30min。随后将PCR管取出，向PCR管中加入50μ1 酪/氯仿（酪：氯仿：异戊醇=25 :24:1，购自北京索莱宝科技有限公司），縱满震荡30s， 1200化pm离屯、5min，取祉1上清液进行琼脂糖凝胶电泳。结果如附图1所示，可W看到对样本 1进行扩增检测到176bp的目的条带，而对样本2则没有检测到目的条带。由此可见，使用本 发明提供的等溫扩增试剂和方法，可W对转基因玉米N0S终止子的特定位置进行有效链替 换扩增，用于检测含有N0S终止子的转基因玉米。
[0036] 实施例2对结核分枝杆菌复合菌群的检测
[0037] 在本实施例中，通过本发明提供的恒溫扩增试剂盒方法对结核分枝杆菌复合菌群 (MTBC)的插入序列IS6110基因片段进行扩增，W实现对结核分枝杆菌复合菌