用于检测番茄晚疫病菌的LAMP引物组合物和应用的制作方法

本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及番茄晚疫病菌的环介导等温扩增（LAMP）检测引物组合物及其应用，可用于番茄晚疫病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于番茄晚疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。

背景技术：

番茄 (Lycopersicon esculentum Miller) 别名西红柿、洋柿子，在植物分类上属于茄科 (Solanaceae) 番茄属 (Lycopersicon)。番茄含有丰富的营养成分，既是蔬菜熟食和生食，又是水果，倍受广大群众的喜爱。据研究测定，每人每天食用 50～100 g鲜番茄，即可满足人体对几种维生素和矿物质的需要。番茄中还含有丰富的抗氧化剂，可以防止自由基对皮肤的破坏，具有明显的美容抗皱效果。随着番茄在我国种植面积的不断扩大和种植指数的不断指高，番茄病虫害种类和危害程度也呈现逐年增加和加重的趋势，其中，由晚疫病菌(Phytophthora infestans)侵染引起的番茄晚疫病是番茄生产上发生最普遍、危害最严重的病害之一，无论在露地还是保护地都造成重大损失，是一种流行性很强的毁灭性病害，一般年份减产20%-30%，严重时可达40%-60%，甚至绝收。番茄晚疫病常与番茄其它病害（如灰霉病、早疫病）混合发生，而且发病初期症状具一定的相似性，常给病害的正确诊断造成极大的困难，在生产中常因病害诊断不准确，未能达到实施“对症下药”的正确防治措施而致使病害造成惨重损失的现象时有发生。因此建立番茄晚疫病菌快速检测体系，在发病初期或症状显现之前对植株是否携带晚疫病菌进行快速准确的检测，这对于病害的准确预测预报、制定适时有效的防治措施、控制病害的传播和流行（蔓延）以及减少病害造成的经济损失都具有重要的理论和实际意义。

植物病原菌传统的检测方法是采用选择性培养基从土壤、植物组织或水体中分离菌株，再对这些菌株的形态等进行鉴定，来确定是否存在病原菌，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定。传统的检测方法不仅费时、准确度低，而且要求检测人员要有丰富的经验，最重要一点是易遗漏潜育期或隐症的病害，以致延误病害的防治，导致病害的暴发，因此传统病原学检测方法已不能满足现代植物病理学研究的需要。

随着分子生物学技术的不断发展，应用PCR、血清免疫学等技术对病原菌进行特异和快速分子检测的成功例子已越来越多，但这些分子生物学技术在一定程度上也存在了一些不足之处，如血清免疫学检测技术在血清的制备过程耗时耗力，常常受到抗血清质量的影响，且可能存在交叉反应，特异性较差，容易造成假阳性，PCR快速检测技术主要包括常规PCR、巢式PCR（Nest-PCR）和实时荧光定量PCR等，PCR技术检测时间较长，需要依靠PCR仪、凝胶成像系统等贵重仪器设备，不利于基层生产上推广应用，上述缺欠限制了这些先进方法的推广应用。

环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）技术是由日本荣研公司开发的一种简便、快速、准确及廉价的核酸高效扩增技术，该技术可在60℃~65℃恒温条件下，利用高活性的链置换DNA聚合酶 (Bst DNA polymerase) 对目的DNA片段进行特异性扩增。在1小时内，能够将少量拷贝数的目的基因扩增至10⁹~10¹⁰个拷贝数。LAMP反应产物不仅可以通过浊度仪、real-time PCR仪及凝胶电泳仪进行检测，而且还可以通过SYBR GreenⅠ、钙黄绿素、羟基萘酚蓝染色后，肉眼识别。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济，且无需特殊设备，检测结果可由肉眼判断，极适合于在基层生产部门推广应用，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道较少，关于番茄晚疫病菌的LAMP检测尚未见报道。在LAMP检测中，国内外多数研究人员主要利用rDNA/ITS序列为靶标基因设计特异引物来对植物病原菌进行快速检测、鉴定。然而疫霉属卵菌的PCR分子检测技术研究结果表明，rDNA/ITS在疫霉属的近缘种之间变化很小，从ITS序列上设计引物很难将两个相似高的种区分开。因此要对疫霉属病原菌进行高灵敏性和特异性检测，应从疫霉菌其它基因上设计引物进行检测。目前用于疫霉菌PCR分子检测的靶标基因主要有elicitin 基因、Ras家族相关的Ypt1编码基因、线粒体Cox1和Cox2编码基因以及可能编码储存蛋白的Lpv基因等。

本发明旨在寻找番茄晚疫病菌中新的分子检测靶标基因。β-tubulin是真核生物看家（管家）基因之一，广泛存在于真核生物中，在真核生物进化上非常保守，目前尚无针对该靶标基因进行晚疫病菌分子检测的报道。

本发明基于环介导等温扩增（LAMP）技术原理，选取疫霉菌β-tubulin基因为检测靶标，在β-tubulin基因序列的6个区域设计了4条番茄晚疫病菌特异性引物，通过对反应体系和反应条件的优化，建立以SYBR Green Ⅰ为荧光显色指示剂的番茄晚疫病菌可视化LAMP 检测技术。该技术操作简单、灵敏度和特异高，且无需贵重仪器设备，适宜于田间番茄晚疫病的早期诊断和病原菌的检测和鉴定，对番茄晚疫病及时、有效的防治具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供用于检测番茄晚疫病菌的LAMP引物组合物和应用，针对现有技术中对番茄晚疫病菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有PCR分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器，且检测时间较长等问题，提供了番茄晚疫病菌新的分子检测方法，对番茄晚疫病菌进行LAMP检测，检测周期短、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。

实现本发明的目的包括下列步骤（技术方案）：

1. 番茄晚疫病菌LAMP检测特异性引物组合物的设计：通过测定番茄晚疫病菌（Phytophthora infestans）和其它镰孢菌（Phytophthora spp）的β-tubulin基因序列，对疫霉属及其它病原菌不同种间β-tubulin基因序列进行比对分析，利用在线LAMP引物设计软件Primer software Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html; Eiken Chemical Co., Japan)设计一套番茄晚疫病菌特异性LAMP引物组，由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成，F3/B3和FIP/BIP引物序列如下：F3: 5’-GCCGATGAGGTCATGTGC-3’，B3: 5’-GTTCACGGCCAGCTTACG-3’，FIP: 5’-AGTGGGGGTGGTGAGCTTCACTG-GACAATGAGGCCCTGTA-3’，BIP: 5’-GGTGACCTGAACCACTTGGTGTGTTC- AGCTGACCGGGGAA-3’。

2. 番茄晚疫病菌LAMP检测方法的建立，包括以下步骤：

（1）提取待测样品基因组DNA。

用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB法进行提取基因组DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r·min^-1离心15 min；取上清液700 µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液（体积比25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r·min^-1离心9 min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r·min^-1离心5 min；取上清液350 µL，加入1/10体积3 mol·L^-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min^-1离心5 min；弃去上清液，加入700µL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0） 溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至100 ng/µL待用。

用于检测植物组织中存在番茄晚疫病菌时，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µL加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增；

用于检测土壤样品中存在番茄晚疫病菌时，采用土壤DNA提取试剂盒，提取DNA。

（2）LAMP反应体系的建立：以步骤（1）提取的DNA为模板，利用外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外侧引物F3和B3各1.0 μL，40 μM内侧引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；

（3）LAMP反应条件：64 ℃温育60 min；

（4）反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在番茄晚疫病菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，不存在番茄晚疫病菌。

本发明的有益效果：本发明建立了番茄晚疫病菌的快速、简便、特异性强、灵敏度高的LAMP检测技术体系，可用于带菌植株组织和土壤中番茄晚疫病菌的检测，或用于番茄晚疫病的发病前期、初期检测，对于确定病害防治的最佳时期具有十分重要的意义。

本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

1、特异性强、结果可靠：靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。普通PCR常用的靶标基因有核糖体基因转录间隔区( Internal transcribed space ,ITS )，然而疫霉属卵菌的分子检测技术研究结果表明，rDNA-ITS在疫霉属的近缘种之间变化很小，从ITS序列上设计引物很难将两个相似高的种区分开。因此要对疫霉属病原菌进行高灵敏性和特异性检测，应从疫霉菌其它基因上设计引物进行检测。β-tubulin是真核生物看家（管家）基因之一，广泛存在于真核生物中，在真核生物进化上非常保守，种间存在丰富的变化，是相比rDNA‐ITS更好的分子检测靶标。本发明分析了番茄晚疫病菌β-tubulin基因和其他病原菌在序列上的差异，选取6个特定区域，设计了4条特异性的LAMP引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，具有很强的特异性。本发明利用所设计出的LAMP引物基础上建立了番茄晚疫病菌LAMP检测方法，只有番茄晚疫病菌能检测出来，其它病原菌均未检测出，多次试验结果均一致，说明本发明LAMP检测方法特异性强，结果可靠。

2、灵敏度高： 本发明对番茄晚疫病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg/ μL，具有很高的灵敏性。

3、实用性好：本发明的LAMP检测方法不像PCR检测法需要要热循环仪（PCR仪）等贵重仪器设备，这样就摆脱了对热循环仪等贵重设备的依赖，只要有稳定的热源，LAMP 反应就可以发生，极大扩展了LAMP使用的范围。同时本发明的LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过的颜色变化便可直接判断结果，从而增加了其在带菌的植株和土壤中检测的应用价值。

4、操作简便快速：本发明提供的检测番茄晚疫病菌的LAMP方法克服了现有技术中番茄晚疫病菌的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差及PCR检测技术需要热循环仪等贵重设备，无法快速检测番茄晚疫病菌的问题。本发明检测方法在64℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到番茄晚疫病菌，不需要复杂仪器，只需一个恒温设备即可，能较好满足对番茄晚疫病菌的现场检测。

附图说明

图1 为本发明番茄晚疫病菌的LAMP特异性检测。图中1、2为番茄晚疫病菌，3-7分别为辣椒疫霉菌、大豆疫霉菌、烟草疫霉菌、恶疫霉菌、棕榈疫霉菌，8为阴性对照，1-2显示绿色荧光。

图2 为本发明番茄晚疫病菌LAMP检测灵敏性。图中1-9模板DNA浓度分别为1ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg、100ag、10 ag，10为阴性对照，1-6显示绿色荧光。

图3 为本发明检测方法对发病植株和带菌土壤中番茄晚疫病菌的检测。图中1为阳性对照，2-3为番茄晚疫病发病叶片，4为番茄晚疫病发病田块土壤，5-6为健康番茄叶片，7为高压灭菌土壤，8为阴性对照， 1-4显示绿色荧光。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述， 但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。

实施例 1：番茄晚疫病菌环介导等温扩增（LAMP）检测特异性引物组合物的设计及引物特异性验证

1.供试菌株基因组DNA的提取

采用CTAB 法提取供试菌株（表1）基因组 DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r·min^-1离心15 min；取上清液700 µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液（体积比25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r·min^-1离心9 min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r·min^-1离心5 min；取上清液350 µL，加入1/10体积3 mol·L^-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min^-1离心5 min；弃去上清液，加入700µL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0） 溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至100 ng/µL待用。

表1 供试菌株

2. 番茄晚疫病菌环介导等温扩增（LAMP）特异引物组合物的设计

通过测定番茄晚疫病菌（Phytophthora infestans）和其它镰孢菌（Phytophthora spp）的β-tubulin基因序列，对疫霉属及其它病原菌不同种间β-tubulin基因序列进行比对分析，利用在线LAMP引物设计软件Primer software Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html; Eiken Chemical Co., Japan)设计一套黄瓜枯萎病菌特异性LAMP引物组，由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成，F3/B3和FIP/BIP引物序列发下：F3: 5’-GCCGATGAGGTCATGTGC-3’，B3: 5’-GTTCACGGCCAGCTTACG-3’，FIP:5’-AGTGGGGGTGGTGAGCTTCACTG-GACAATGAGGCCCTGTA-3’，BIP:5’-GGTGACCTGAACCACTTGGTGTGTTC- AGCTGACCGGGGAA- 3’。

3.番茄晚疫病菌LAMP检测方法的建立及引物特异性验证

以表1供试菌株的DNA为模板，利用外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外侧引物F3和B3各1.0 μL，40 μM内侧引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2wt.% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：64 ℃温育60 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定。待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在番茄晚疫病菌，橙色（橘黄色）判断为阴性，不存在番茄晚疫病菌。

4.引物特异性验证结果

LAMP扩增结果表明，供试的菌株中只有番茄晚疫病菌显色结果可观察到绿色荧光，其余疫霉菌和真菌显色结果为橙色（附图1），说明所设计的番茄晚疫病菌外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP可以将番茄晚疫病菌与其它病原菌区分开来，具有种的特异性，可用于番茄晚疫病菌快速可靠的检测和鉴定。

实施例2：番茄晚疫病菌环介导等温扩增（LAMP）检测灵敏度测定

1.不同浓度基因组DNA的制备

用无菌超纯水对番茄晚疫病菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用；

2. LAMP检测方法灵敏度测定及结果观察

以不同浓度的番茄晚疫病菌基因组DNA为模板，利用外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外侧引物F3和B3各1.0 μL，40 μM内侧引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，不同浓度DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：64 ℃温育60 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色（橘黄色）判断为阴性。

3. LAMP扩增灵敏度检测结果

LAMP扩增灵敏度检测结果表明，1ng、100pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg/μL浓度的番茄晚疫病菌基因组DNA显色结果可观察到绿色荧光，其余浓度及阴性对照显色结果为橙色，说明所设计的番茄晚疫病菌外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP通过LAMP扩增，对番茄晚疫病菌的检测灵敏度可达10 fg/μL（附图2）。

实施例3：发病组织中番茄晚疫病菌的LAMP检测

样品采集：从福建周宁、三明、连城采集番茄晚疫病发病症状典型的叶片及健康叶片带回实验室备用；

植物组织DNA的提取：采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µL加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。

LAMP扩增检测及观察：以上述提取的DNA为模板，利用外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外侧引物F3和B3各1.0 μL，40 μM内侧引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄， 1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2wt.% Trion X-100】 12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：64 ℃温育60 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色（橘黄色）判断为阴性。

检测结果：检测结果（附图3）表明，番茄晚疫病发病的叶片通过LAMP扩增，显色结果可观察到绿色荧光，说明存在番茄晚疫病菌，而健康叶片及阴性对照显色结果为橙色，说明不存在番茄晚疫病菌，该套技术能用于植物组织中番茄晚疫病菌的快速分子检测。

实施例4：带菌土壤中番茄晚疫病菌的LAMP检测

样品采集：从福建周宁、三明和连城番茄晚疫病发病严重的田块采集植株根部土壤带回实验室备用，以高压灭菌的土壤为对照；

土壤DNA提取：采用Sigma公司的土壤DNA提取试剂盒（Sigma,DNB100,Soil DNA Isolation Kit）提取土壤中的总DNA，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。

LAMP扩增检测及观察：以上述提取的DNA为模板，利用外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25 μL，包括5 μM外侧引物F3和B3各1.0 μL，40 μM内侧引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄， 1.6 mol/L甜菜碱(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100】 12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL；LAMP反应条件：64 ℃温育60 min；反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0 μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色（橘黄色）判断为阴性。

检测结果：检测结果（附图3）表明，番茄晚疫病发病严重田块土壤DNA通过LAMP扩增，显色结果可观察到绿色荧光，说明存在番茄晚疫病菌，而高压灭菌土壤及阴性对照显色结果为橙色，说明不存在番茄晚疫病菌，该套技术可用于土壤中番茄晚疫病菌的快速分子检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 用于检测番茄晚疫病菌的LAMP引物组合物和应用

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gccgatgagg tcatgtgc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gttcacggcc agcttacg 18

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agtgggggtg gtgagcttca ctggacaatg aggccctgta 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggtgacctga accacttggt gtgttcagct gaccggggaa 40