一种防治马铃薯晚疫病的生防菌剂的制作方法

本发明涉及一种防治马铃薯晚疫病的生防菌剂，属于农作物病害防治技术领域。

背景技术：

由晚疫病菌（phytophthorainfestans(mont)debary）引起的晚疫病是马铃薯生产上一种毁灭性的病害，在世界各马铃薯主产区均有发生和流行，严重威胁着马铃薯的生产，其造成的危害、防治难度及对社会影响已超过水稻稻瘟病和小麦条锈病，被视为国际第一大作物病害。晚疫病在我国发生普遍而严重，每年因感晚疫病造成约80亿元人民币的经济损失，已成为限制我国马铃薯生产和实现产业化的第一大障碍。

目前为止，晚疫病防治主要还是依靠培育抗病品种和化学农药的大量使用。其中培育抗病品种是防治疫病最成功的措施，但是晚疫病菌毒性组成具多变异性特点，导致利用主抗基因育成的抗病品种抗性丧失，而在短时间内筛选并培育出具有抗疫病的新品种是非常困难的。化学农药对农业的发展虽然起着重要的作用，但化学农药的长期使用会带来许多负面影响。使用化学农药不仅缺乏长期的有效性，还出现生态环境被破坏、人畜和有益生物中毒、化学性物质在粮食和饲料中残留量大大超标，影响人畜生存质量等诸多问题，许多国家和地区已经相继禁止了一些高毒、高残留化学农药的生产和使用。在当今人们越来越关注自己的生存环境，及越来越提倡绿色生活的时代，探索有效的生防措施无疑具有重大的理论和现实意义。

放线菌（actinomycetes）分布广，种类多，代谢功能各异，是一类具有极大价值的微生物资源。目前从微生物中发现约8000种生物活性物质当中，近70%是由放线菌产生，特别是链霉菌产生的抗生素在农业生产中应用广泛，其具有防效时间长、无毒、无害、无残留、无污染等优点，在农业生产中已经取得了较大的环境效益和经济效益，具有广阔的开发前景。因此，通过筛选和利用拮抗菌达到高效、环保的生物防治目的已成为当前农业科学研究的热点之一。

技术实现要素：

本发明的目的在于：针对目前马铃薯晚疫病严重发生，且面积逐年扩大，化学防治效果不理想，同时带来环境污染的问题，提供一种防治马铃薯晚疫病的生防菌剂。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种防治马铃薯晚疫病的生防菌剂，由疮痂链霉菌(streptomyceseuropaeiscabiei)st19发酵而成，其制备方法为：

1）种子液的制备：将所述的疮痂链霉菌st19接种于高氏一号液体培养基中，28℃，150r/min，培养5d，制成种子液；

2）发酵：将种子液接种于发酵培养基中，发酵条件为：接种量1%~2%vol、装瓶量100ml/250ml、发酵培养基初始ph值7.0~7.2，28℃，150r/min，发酵时间9d，得发酵液；

3）无菌滤液的制备：将发酵液4000r/min离心5min后，用0.45µm灭菌微孔滤膜过滤除菌，得无菌滤液即为所述生防菌剂。

其中，步骤2）所述发酵培养基配方为：可溶性淀粉2%wt、葡萄糖1.5%wt、黄豆粉2%wt、mgso4·7h2o0.05%wt、k2hpo40.1%wt、nacl0.1%wt、caco30.2%wt，其余为蒸馏水。

所述疮痂链霉菌st19保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年3月24日，保藏号为cgmccno.8962。

其应用方式有以下两种：

1）在马铃薯幼苗期或成株期灌根使用：在马铃薯幼苗期或成株期连续使用2~3次，每次间隔7~10d；

2）与有机肥混合制成菌肥使用。

本发明有益效果：

本发明所述防治马铃薯晚疫病的生防菌剂能够明显抑制马铃薯晚疫病菌的生长。由于是生物制剂，因此没有化学农药使用带来的一系列问题，可减少农田污染，且能有效防治马铃薯晚疫病。

本发明所使用的生防放线菌分离自马铃薯根围土壤，与土壤生态和谐相容，有利于充分发挥菌株的优势。

本发明所使用的生防放线菌菌株培养条件简单，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1为菌株st19在高氏一号培养基上的菌落形态；

图2为菌株st19气生菌丝和孢子丝形态（光学显微镜下400×）；

图3为菌株st19菌丝形态（电子显微镜5000×）；

图4为菌株st19拮抗菌无菌滤液对马铃薯晚疫病菌的平板抑菌效果图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步阐述，但并不是对本发明的限制。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例一拮抗放线菌的分离

具体过程如下：

1、土壤样品的采集

从福建省周宁县采集不同马铃薯地块5~10cm深处的根围土壤，分装标记后带回实验室，待自然风干后分离。

2、放线菌的分离

采用平板稀释法进行分离。称取土壤样品10g，倒入装有小玻璃珠和90ml无菌水的三角瓶中，震荡30min后静置5min，依次稀释10倍，分别配制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的悬浮液，吸取不同浓度的悬浮液各0.1ml加到高氏一号培养基（加入终浓度为50mg/l的k2cr2o7）平板上，均匀涂布后置于28℃培养观察，5~7d后挑取不同的单菌落划线纯化。将纯化后的菌株转接到高氏一号斜面培养基上培养，4℃保存备用，共分离得到85株放线菌。

实施例二菌株st19的鉴定

1、形态特征观察

将菌株st19划线接种在高氏一号培养基上，28℃培养10d后，观察菌落的形态（图1），同时以45℃斜插入无菌盖玻片，28℃培养7d后，取出盖玻片在光学显微镜和电子显微镜下观察菌丝的形态特征（图2和图3）。

2、培养特征观察

采用《链霉菌鉴定手册》推荐的8种培养基，将菌株st19于28℃培养7~10d后观察菌体生长情况，记录气生菌丝、基内菌丝的颜色以及是否产生可溶性色素。菌株st19在高氏一号培养基、察贝克培养基、淀粉铵培养基、pda培养基、葡萄糖酵母膏培养基和燕麦培养基上生长良好，基内菌丝和气生菌丝发育良好；而在克氏一号培养基和葡萄糖天门冬素培养基上生长较差，在高氏一号培养基和pda培养基上产生黄褪色或棕褪色可溶性色素(表1)。根据以上形态特征分析，对照链霉菌鉴定手册，将st19初步鉴定为疮痂链霉菌。

表1菌株st19在不同培养基上的培养特征

3、16srdna序列分析

基因组提取试剂盒提取菌株st19基因组dna后，采用通用引物f:5'-agagtttgatcctggctcag-3'和r:5'-ggttaccttgttacgactt-3'，进行16srdna的pcr扩增。回收pcr扩增产物得到st19-16srdna，经连接、转化、鉴定后，阳性克隆送生工生物工程（上海）有限公司测序得核苷酸序列信息，序列全长为1548bp（请见序列）。将所得序列提交到genbank数据库进行blast分析比对，发现与st19同源性较高的菌株均属于链霉菌属，其中与菌株streptomyceseuropaeiscabiei相似性达到99%，并结合形态学特征和培养特征，将菌株st19鉴定为疮痂链霉菌(streptomyceseuropaeiscabiei)。

实施例三st19菌株发酵工艺的优化

将上述菌株接种于高氏一号液体培养基中，28℃，150r/min，培养5d后，制成种子液，接种于发酵培养基中。以马铃薯晚疫病菌为靶标菌，通过对碳源、氮源的筛选以及营养条件单因子试验和正交试验后，得到该菌株的最佳发酵培养基配方为：可溶性淀粉2%wt、葡萄糖1.5%wt、黄豆粉2%wt、mgso4·7h2o0.05%wt、k2hpo40.1%wt、nacl0.1%wt、caco30.2%wt，其余为蒸馏水。最佳发酵条件为：接种量1%~2%vol、装瓶量100ml/250ml、发酵培养基初始ph值7.0~7.2，28℃，150r/min，发酵时间9d。将发酵液4000r/min离心5min后，用0.45µm灭菌微孔滤膜过滤除菌，得无菌滤液。

实施例四菌株st19无菌滤液抑菌测定

采用生长速率法测定相对抑菌率，将无菌滤液与冷却至40℃左右的黑麦培养基按体积比1:10混匀倒平板，以同比例加入无菌水的黑麦培养基为对照。取菌龄一致、直径5mm晚疫病菌丝块置于黑麦平板中央，置于20℃的恒温箱中培养，15d后定时测量菌落直径，计算相对抑菌率，每处理重复5次，结果表明菌株st19对马铃薯晚疫病菌具有较好的拮抗作用（图4）。

实施例五菌株st19发酵液盆栽防效试验

选取3~5叶大小马铃薯晚疫病高感品种（费乌瑞它）苗，每株苗浇灌50mlst19菌株发酵液（约10⁹cfu/ml）。24h后灌根接种马铃薯晚疫病菌游动孢子悬浮液（5×10⁴个/ml），每株20ml。接种4d后再浇灌一次100mlst19菌株发酵液。以50%安克可湿性粉剂1000倍液灌根处理作为农药对照，以清水处理的植株作为空白对照。每个处理15株苗，每处理3次重复。待发病后每天调查发病情况，统计发病率和病情指数，直至清水对照发病率达到80%以上时结束实验。

病情分级标准如下：

0级：无病斑；

1级：病斑面积占整个叶片面积的5%以下；

3级：病斑面积占整个叶片面积的6%-10%；

5级：病斑面积占整个叶片面积的11%-20%；

7级：病斑面积占整个叶片面积的21%-50%；

9级：病斑面积占整个叶片面积的50%以上。

病情指数（%）=[∑病级叶片数×代表数值)／(最重病级数×总叶片数)]×100%

防治效果（%）=[(空白对照病情指数－处理病情指数)／空白对照病情指数]×100%

实验结果见表2，该结果表明供试放线菌st19发酵液能够显著降低马铃薯晚疫病的病情指数，防治效果高达74.65%，仅略低于化学农药50%安克可湿性粉剂1000倍液的防治效果80.22%。温室盆栽实验结果说明，st19菌株能够有效防治马铃薯晚疫病，表现出良好的应用潜力。

表2放线菌st19发酵液对马铃薯晚疫病的防治效果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>福建省农业科学院植物保护研究所

<120>一种防治马铃薯晚疫病的生防菌剂

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