一种基于重组酶聚合酶扩增技术原理的组织胞浆菌感染分子诊断试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及分子检测技术领域，具体地说，涉及一种基于重组酶聚合酶扩增技术 原理、可早期诊断组织胞浆菌感染的分子诊断试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 组织胞浆菌属是一个常见于鸟类和蝙蝠粪便的双相型真菌属，在自然状态下为菌 丝相，而在动物或人体内转化为酵母相。组织胞浆菌属包含三个物种，即荚膜组织胞浆菌 (Histoplasma capsulatum)、荚膜组织胞衆菌杜氏变种（Histoplasma var · duboisii)和马 皮疽荚膜组织胞楽菌(Histoplasma capsulatum var .farciminosum)。其中，马皮疽荚膜组 织胞浆菌主要感染动物，在马等动物中造成淋巴管炎家畜流行病；而组织胞浆菌病 (Histoplasmosis，HP)是由双相型组织胞衆菌所引起的广泛分布于全球的真菌病，其主要 分为由荚膜组织胞浆菌所引起的美洲型HP和由荚膜组织胞浆菌杜氏变种所引起的非洲型 HP〇
[0003] 人类常因吸入被鸟类或蝙蝠粪便污染的泥土或尘埃中的真菌孢子而感染。临床误 诊率、死亡率高达80%。1906年美国军事病理学家塞缪尔?泰勒?达林报道了首例，当时研 究表明最普遍的是俄亥俄州和密西西比河谷。近百年来的研究大多认为该病是一种地方性 流行病，临床表现多样，总体分为无症状型、急性肺型、播散型以及慢性肺型，主要流行于美 洲、非洲、亚洲等地区，欧洲相对少见，故既往该病在我国未引起足够重视，然而近20年来相 关报道呈上升趋势，例如桂希恩等流行病学调查显示我国存在组织胞浆菌感染的人群，并 且有地域差异，东南部地区感染率高于西北部;肺部疾病患者感染率高于正常人，尤以肺结 核患者为高。值得注意的是，由于荚膜组织胞浆菌在形态上和马尔霉尼青霉菌无法可靠区 分，明确诊断需要培养和血清血试验，费时费力，对实验室资质要求高，故该病的诊断学技 术现状远不能满足临床实际需要。
[0004] 而且，HP感染的预后与能否早期明确诊断密切相关，因此如何推动HP诊断的研究， 尽快开发出快速、特异且易于操作的诊断技术方法，是目前临床HP感染早期检测技术研究 迫切需要解决的重要问题。目前，国内外临床真菌实验室血清学试验曾使用乳胶凝集、免疫 扩散、补体结合、免疫萤光及放射免疫检验抗体，但发病早期诊断率低。组织胞浆菌素皮试 可能有助于慢性患者的诊断，但免疫缺陷者常不出现反应，因此皮肤试验仅主要用于流行 病调查。近来国外亦常检测患者尿液、血清、胸水或脑脊液的组织胞浆菌多糖抗原，其中尿 液阳性率最高，并提示活动性感染，可作早期诊断依据。以培养、病理检查为代表的病原真 菌形态学诊断方法虽有耗时长等局限，但仍是临床上侵袭性真菌病诊断的金标准，组织胞 浆菌病亦不例外。由于其菌体大小及形态与利什曼原虫无鞭毛体相似，二者常被混淆，后者 存在细小杆状着色深的动基体，而前者无动基体，这是形态上区别两种病原体的关键，但是 却对病理镜检人员要求颇高。最可靠的病原诊断是真菌培养或动物接种，骨髓、病变组织穿 刺物、血、痰均可作培养，但存在假阴性率较高、耗时长(培养时间至少2周)等缺陷。近年来， 非培养诊断技术逐渐成为国内外侵袭性真菌病早期诊断技术研究的热点，其技术路线主要 是基于免疫学原理的血清学方法和以核酸检测技术为代表的分子生物学方法。总体而言， 这两大类技术方法各有优势，虽然部分血清学技术方法经过改进相对成熟，敏感性及特异 性尚可，但基于免疫学原理的固有属性也导致无法规避假阳性、假阴性等问题;而以核酸检 测技术为代表的分子生物学技术方法虽尚未完全成熟，但具有很好地弥补目前血清学方法 的弊端的技术优势，具有较高的发展潜力与临床应用价值。
[0005] 基于核酸检测原理的HP早期诊断技术主要包括DNA条形码图谱技术和DNA序列分 析等。理论上讲，DNA序列分析是鉴定组织胞浆菌的金标准。但PCR技术需要PCR仪器，对基础 设施和人员要求较高，常因国内实验室不能严格分区、实验人员经验不足加上高灵敏度、易 污染使结果呈现假阴性、假阳性等。重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术，由英国公司TwistDx Inc开 发。RPA技术主要依赖于三种酶:能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋 白（SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37°C 左右。以此为基础的TwistAmp⑧核酸扩增产品能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸 检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、 农业等领域。目前RPA技术被广泛用于艰难梭状芽孢杆菌、结核杆菌、耐甲氧西林金黄色葡 萄球菌MRSA、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、沙门氏菌、大肠埃希菌STEC等常见 致病菌的检测。
[0006] 综上所述，基于针对组织胞浆菌菌株基因组各DNA片段的序列分析，筛选出适当的 靶基因，研发一种基于RPA技术原理的组织胞浆菌感染早期快速诊断的技术方法，对于解决 临床上组织胞浆菌感染确诊时间周期长、对检测人员技术和实验室平台条件要求高等问题 具有十分重要的意义，将为临床上早期诊断和及时治疗提供便利。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种可早期诊断组织胞浆菌感染的 引物对。
[0008] 本发明的再一的目的是，提供所述的引物对的用途。
[0009] 本发明的另一的目的是，提供一种可早期诊断组织胞浆菌感染的试剂盒。
[0010] 为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
[0011] -种可早期诊断组织胞浆菌感染的引物对，所述的引物对由核苷酸序列分别为 SEQN0.1和SEQN0.2的两条引物组成。
[0012] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0013] 如上所述的引物对在制备早期诊断组织胞浆菌感染的试剂中的用途。
[0014] 如上所述的引物对在制备检测样品中组织胞衆菌存在的试剂中的用途。
[0015] 如上所述的引物对在制备试剂中的用途，所述的试剂用于从粗球孢子菌 (Coccidioides immitis)、申克抱子丝菌（Sporothrix schenckii)、马尔尼菲青霉菌 (Penicillium marneffei)、胶囊青霉菌(Penicillium capsulatum)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、尼日尔黑曲霉(Aspergillus niger)、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)、 雅致鱗质霉（Apophysomyces elegans)、苯黑末节皮真菌(Arthroderma benhamiae)、皮炎 芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球抱子菌(Coccidioides posadasii)、热带 金抱子菌（Chrysosporium tropicum)、嗜角质金抱子菌（Chrysosporium keratinophilum)、据形放线菌（Ctenomyces serratus)、絮状表皮癣菌（Epidermophyton floccosum)、巴其斤德金抱子菌（Emmonsia pasteurian)、小金抱子菌（Emmonsia parva)、尖 孢镰刀菌（Fusarium oxysporum)、前病镰刀菌（Fusarium solani)、里西裸囊菌 (Gymnoascus reessii)、犬小抱子菌（Microsporum canis)、石膏样小抱子菌(Microsporum gypseum)、马蹄足小抱子菌（Microsporum equinum)、卷枝毛霉（Mucor circinelloides)、 印度毛霉菌(Mucor indicus)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、阿萨丝抱酵母 (Trichosporon asahii)、皮瘤丝抱酵母（Trichosporon inkin)、红色毛癣菌 (Trichophyton rubrum)、米根霉（Rhizopus oryzae)、糖批马拉色菌（Malassezia furfur)、白念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌（Candida glabrata)、热带假丝酵母 (Candida tropicalis)、链状假丝酵母菌（Candida catenulata)、克柔念珠菌（Candida krusei)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、格特隐球菌(Cryptococcus Gattii)中 鉴别出组织胞浆菌。
[0016] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
[0017] -种可早期诊断组织胞浆菌感染的试剂盒，所述的试剂盒包含如上所述的引物 对：
[0018] 所述的试剂盒还进一步包括 rwistAnip'? RPA Rehydration Buffer、magnesium [0019]本发明优点在于：
[0020]本发明针对组织胞浆菌我国临床最常见的优势分布的变种组织胞浆菌荚膜变种 的rDNA区