目标基因的捕获试剂盒及捕获方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种目标基因的捕获探针、包括目标基因的 捕获探针的捕获试剂盒及捕获目标基因的方法。
【背景技术】
[0002] 快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一直具有十分重要的意 义。对于每个生物体来说，基因组包含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反 映基因组DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的复杂性和多样性，因而在生命 科学研究中扮演了十分重要的角色。
[0003] 测序技术最早可以追溯到20世纪50年代，早在1954年就已经出现了关于早期测 序技术的报导，即Whitfeld等用化学降解的方法测定多聚核糖核苷酸序列。1977年Sanger 等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技 术的诞生。此后在三十几年的发展中陆续产生了第二代测序技术，包括Roche公司的454技 术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术。相比传统的Sanger测序法，新 一代测序技术的推出及普及，使得基因测序的通量和质量大幅提高，而测序成本逐步降低。 目前Roche, Illumina等公司推出的小型实验台测序仪价格非常低廉，感兴趣的客户群也 非常之多。
[0004] 目前临床癌症的早期诊断和个性化指导用药需要对病人进行相关基因的测序。然 而Roche，Illumina等公司推出的配套测序平台使用的试剂盒仅仅适用于全基因组或者全 外显子的测序，而全基组测序或全外显子的测序对于大样本量的研究仍然费用太高，不适 合癌症的早期诊断和个性化指导用药。因此要想真正能够把二代测序技术推向临床，能够 满足医生的需求，就需要设计针对特定疾病的靶向基因的测序试剂盒。
[0005] 目前Illumina公司和Life technologies公司都提供祀向基因的捕获试剂盒， 然而上述公司的试剂盒产品针对的靶向基因的数目不全，并非全区域覆盖。如Illumina 公司的 TruSeq Amplicon-Cancer Panel，共检测 48 个基因，而 Life technologies 公司的 AmpliSeq Cancer Hotspot Panel,共检测50个基因中的热点位点而非全部区域。而且以 上商业试剂盒虽然均能达到90%以上的覆盖率，但是仍然有10%区域的缺失，并且每个区 域的覆盖深度不同，无法进行定量的分析。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的一个目的是提供一种目标基因的捕获探针，为生物素标记的 目标基因的特异性探针组，所述目标基因包括如下63个基因：
[0007]
[0008] 在一些实施方案中，所述特异性探针组包括至少一条针对每个目标基因的特异性 探针序列。
[0009] 在另一些实施方案中，所述特异性探针组包括两条以上的针对每个目标基因的特 异性探针序列。
[0010] 进一步的，所述的捕获探针中，所述特异性探针序列由通用接头A、目标基因特异 性序列和通用接头B组成，其中通用接头A的核苷酸序列如SEQ IDN0. 1所示，通用接头B 的核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0011] 在一个优选实施方案中，所述特异性探针组包括如SEQ ID NO. 3-SEQ IDN0. 1253 示核苷酸序列。
[0012] 本发明的一个目的是提供一种目标基因的捕获方法，为构建样本基因组DNA文 库，与上述目标基因的捕获探针杂交，亲和素包被的磁珠捕捉与目标基因的捕获探针结合 的DNA片段。
[0013] 本发明的另一个目的是提供一种目标基因的捕获试剂盒，包括上述目标基因的捕 获探针。
[0014] 在一些实施方案中，本发明所述目标基因的捕获试剂盒，还包括杂交混合液、杂交 缓冲液、洗涤液A、洗涤液B和洗脱液中的至少一种。
[0015] 在一个优选实施方案中，所述目标基因的捕获试剂盒中，所述杂交混合液含有浓 度为SOOng/yL人Cot-1 DNA和浓度为SOOng/yL鲑鱼精子DNA，所述杂交缓冲液含有 10XSSPE 缓冲液、10X 邓哈特溶液（Denhardt's Solution)、10mM EDTA 和 0· 1% SDS，所述 洗涤液A含有1 X SSC和0. 1 % SDS，所述洗涤液B含有0. 1 X SSC和0. 1 % SDS，所述洗脱液 含有 0. 1M NaOH。
[0016] 本发明提供了一种目标基因的捕获探针、包括目标基因的捕获探针的捕获试剂盒 及捕获目标基因的方法。本发明所述目标基因的捕获探针为生物素标记的63个目标基因 的特异性探针组，其与全基因组DNA杂交，运用链霉亲和素包被的磁珠，可将与探针结合的 DNA片段捕捉下来，在进行二代高通量测序前实现对特定目标基因组区域的富集。本发明所 述目标基因的捕获探针覆盖率广，测序深度深，极大的提高了基因组中目标区域的研究效 率，显著降低了测序成本。本发明所述目标基因捕获试剂盒组成简单，适用范围广，而且成 本低，适用于广大的实验室和科研工作。
【具体实施方式】
[0017] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0018] 本发明提供了一种目标基因的捕获探针，为生物素标记的目标基因的特异性探针 组。
[0019] 其中按照本领域技术人员的理解，本发明所述目标基因为特定疾病的靶向基因。 目前已公开报道的特定疾病的靶向基因有很多种，如肺癌的易感基因 ABCC1，与遗传性乳腺 癌有关的基因 BRCA1和BRCA2。
[0020] 在一些实施方案中，所述目标基因包括如下63个基因：
[0021]
[0022] 本发明中上述目标基因的序列都可通过GenBank基因序列号从GenBank数据库获 得。GenBank数据库是1982年由美国国立生物技术信息中心（NCBI)建立并维护的综合性 序列数据库。如下表1为本发明中所涉及的目标基因对应的GenBank基因序列号。
[0023] 本发明所使用的术语"探针"就是一段与目标基因互补的特异核苷酸序列，它可以 包括整个基因，也可以仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的 RNA〇
[0024] 表1目标基因的Genebank序列号
[0025]
[0027] 在一些实施方案中，本发明所述的捕获探针中，所述特异性探针组由针对目标基 因的特异性探针序列组成，所述特异性探针序列由通用接头A、目标基因特异性序列和通用 接头B组成。
[0028] 在一些优选实施方案中，所述通用接头A长度为15nt，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；所述通用接头B的核苷酸序列长度为15nt，其核苷酸如SEQ ID NO. 2所示。
[0029] 本领域技术人员可以根据NCBI数据库中公开的目标基因的参考序列，设计与目 标基因的外显子互补的目标基因特异性序列，然后与通用接头A和通用接头B组成特异性 探针序列。
[0030] 在一些实施方案中，所述目标基因特异性序列长度为120nt。与通用接头A和通用 接头B组合后，特异性探针序列长度为150nt。
[0031] 本发明中上述所有的63个目标基因中，每个基因都有多个外显子区域，每个外显 子区域都至少有一条探针，在一些实施例中，每个区域都至少有二条探针；在一些实施例 中，每个区域都至少有三条探针；在一些实施例中，每个区域都至少有五条探针；在一些实 施例中，每个区域都至少有十条探针；在一些实施例中，每个区域都至少有二十条探针。
[0032] 在一些实施方案中，所述特异性探针组包括至少一条针对每个目标基因的特异性 探针序列。即所述特异性探针组针对每个目标基因至少包括一条特异性探针序列。
[0033] 在另一些实施方案中，所述特异性探针组包括两条以上的针对每个目标基因的特 异性探针序列。
[0034] 其中，申请人根据NCBI数据库中公开的目标基因的参考序列，设计表2所示的与 所述63个目标基因的外显子互补的特异性探针序列。
[0035] 表263个目标基因的特异性探针序列
[0036]
[0037] 本领域技术人员可以理解本发明所述与所述63个目标基因的外显子互补的特异 性探针序列包括但不限于表2所示序列。
[0038] 在一个优选实施方案中，所述特异性探针组包括上述表2所示的每个目标基因的 特异性探针序列中的至少一条。如包括针对ABCC1基因的特异性探针序列SEQ ID N0. 3、针 对ABL基因的特异性探针序列SEQ ID NO. 34、……、针对VHL基因的特异性探针序列SEQ ID NO. 1251。即所述特异性探针组包括63条特异性探针序列，每个特异性探针序列特异性 识别上述63个目标基因中的一个。
[0039] 在一些实施例中，所述特异性探针组包括上述表2所示的每个目标基因的特异性 探针序列中的至少二条；所述特异性探针组包括上述表2所示的每个目标基因的特异性探 针序列中的至少三条；所述特异性探针组包括上述表2所示的每个目标基因的特异性探针 序列中的至少五条。
[0040] 在另一个优选实施方案中，所述特异性探针组包括如SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 1253所示核苷酸序列。即所述特异性探针组包括上述表2所示的与所述63个目标基因 的外显子互补的所有特异性探针序列。
[0041] 本发明所述生物素标记的目标基因的特异性探针组中生物素标记可采用PCR或 缺口平移法来完成。优选的，采用缺口平移法。
[0042] 所述缺口平移法包括以DNase I在DNA双链上作用产生缺口并以此作为第二反应 步骤的作用起点，即大肠杆菌聚合酶I自缺口处进行修补合成。在修补合成互补链时将生 物素标记的d-NTP掺入，从而复制出带有生物素标记的探针。
[0043] 本发明还提供一种目标基因的捕获方法，为构建样本基因组DNA文库，与上述目 标基因的捕获探针杂交，亲和素包被的磁珠捕捉与目标基因的捕获探针结合的DNA片段。
[0044] 其中，所述样本基因组DNA文库的构建可以按照本领域技术人员公知的方法，利 用商品化的建库试剂盒进行。
[0045] 在一个实施方案中，所述样本基因组DNA文库是利用illumina标准建库试剂盒进 行构建，得到250ng/y L的200bp-350bp标准文库片段。
[0046] 在一个实施方案中，本发明所述目标基因的捕获方法中，所述与目标基因的捕获 探针杂交具体为杂交缓冲液与标准文库片段混合，预热后在65°C与杂交缓冲液、目标基因 的捕获探针、RNA酶抑制剂混合，在65°C保持16-18h。其中所述杂交混合液含有浓度为 500ng/ μ L人Cot-1 DNA和浓度为500ng/ μ L鲑鱼精子DNA，所述杂交缓冲液含有10 X SSPE 缓冲液、10Χ 邓哈特溶液（Denhardt，s Solution)、10mM EDTA 和 0· 1% SDS。
[0047] 在一个实施方案中，本发明所述目标基因的捕获方法中，所述亲和素