基因甲基化检测方法和检测试剂盒及其应用与流程

本发明属于生物领域，特别涉及基因的甲基化检测。

背景技术：

本发明涉及基因检测领域，特别是涉及一种能够提高基因甲基化检测灵敏度的方法及其试剂盒。DNA甲基化与肿瘤的发生发展密切相关，它是肿瘤发生的一个早期事件，由于CPG岛的高度甲基化早于肿瘤增生，故检测某些DNA位点的甲基化可以作为肿瘤标志物，是肿瘤早期辅助诊断、患病预测及疗效评估的一个潜在指标。DNA甲基化分析通常需要对DNA进行高温硫化转化修饰。高温硫化转化后，双链DNA会解离成两条不互补的单链。目前在现有的甲基化检测技术中还没有同时检测同一基因两条单链的甲基化总体水平的先例，现有的基因甲基化检测技术都是针对一条单链进行PCR反应，从而检测基因甲基化情况。在某类肿瘤检测中，DNA甲基化的程度不是很明显，单链检测基因甲基化的灵敏度较低，必须采用定量法才可确定基因甲基化的程度，进而区分癌与非癌。定量法分析较为麻烦复杂，远不如定性法分析简单。单链检测基因甲基化没有充分考虑基因两条链甲基化的总体水平。例如申请号为201610264899.7《一种人体外周血游离DNA中septin9基因甲基化检测试剂盒及检测方法》。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明其中一个目的在于提高基因甲基化检测灵敏度，能够充分检测基因两条链的甲基化总水平。以内参基因为标准衡量本发明方法的准确性和有效性。

本发明提供了一种基因甲基化检测方法，该方法首先针对目的基因设计目的基因甲基化正义链的引物对和目的基因甲基化反义链的引物对，以及设计检测目的基因甲基化的正、反义链的两条探针，目的基因甲基化正义链的引物对为目的基因甲基化正义链的正向引物和目的基因甲基化正义链的反向引物，目的基因甲基化反义链的引物对为目的基因甲基化反义链的正向引物和目的基因甲基化反义链的反向引物，目的基因甲基化的正、反义链的两条探针分别为目的基因甲基化正义链探针和目的基因甲基化反义链探针。由于该方法考虑基因两条链甲基化的情况设计相关引物和探针，使用设计的引物和探针可以检测目的基因甲基化的整体水平。以内参基因为标准衡量本发明方法的准确性和有效性。

根据本发明的一方面，还提供了一种基因甲基化检测方法，目的基因为septin9基因，所述septin9甲基化位点为启动子区的CpG岛，序列为转录起始位点上游的-670～-555bp区；

根据本发明的一方面，还提供了一种基因甲基化检测方法，

目的基因septin9甲基化正义链的正向引物序列如SEQ No.1：

5’-TCGTTGTTTATTAGTTATTATG-3’

目的基因septin9甲基化正义链的反向引物序列如SEQ No.2：

5’-TCCGAAATAATCCCATCCCAT-3’

目的基因septin9甲基化反义链的正向引物序列如SEQ No.3：

5’-TTCGAAATGATTTTATTTAGTTG-3’

目的基因septin9甲基化反义链的反向引物序列如SEQ No.4：

5’-CGCTACCCACCAACCATC-3’；

根据本发明的一方面，还提供了一种基因甲基化检测方法，

目的基因septin9甲基化正义链探针序列如SEQ No.5：

5’-TAACCGCGAAATCCGACATA-3’

目的基因septin9甲基化反义链探针序列如SEQ No.6：

5’-TATACCGAACCCCGCGATCA-3’。

根据本发明的一方面，还提供了一种基因甲基化检测方法，目的基因septin9甲基化正义链探针、目的基因septin9甲基化反义链探针5'端报告荧光基团为FAM，目的基因septin9甲基化正义链探针、目的基因septin9甲基化反义链探针3'端的猝灭基团为BHQ1。

根据本发明的一方面，还提供了一种基因甲基化检测方法，使用内参基因甲基化的引物对和内参基因甲基化探针，内参基因为ACTB，

内参基因引物序列如SEQ No.7：

ACTB-F:5’-GAATTTGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGT-3’，

内参基因引物序列如SEQ No.8：

ACTB-R:5’-CCTACTCCTCCCTTAAAAATTACAA-3’，

内参基因甲基化探针序列如SEQ No.9：

ACTB-probe:5’-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’。

根据本发明的一方面，还提供了一种基因甲基化检测方法，方法步骤为：

A、从待测样本中提取DNA，

B、对提取的DNA进行硫化转化修饰，

C、对修饰后的DNA进行纯化，得到样本模板，

D、将所述目的基因甲基化正义链的正向引物、目的基因甲基化正义链的反向引物、目的基因甲基化反义链的正向引物序、所述目的基因甲基化反义链的反向引物、目的基因甲基化正义链探针和目的基因甲基化反义链探针、内参基因甲基化的引物对和内参基因甲基化探针以及所述样本模板同时加到同一孔中进行PCR扩增反应，

E、计算目的基因正、反义双链荧光累积法中septin9基因CP值；以内参基因为标准衡量本发明方法的准确性和有效性。

根据本发明的一方面，还提供了一种基因甲基化检测方法，PCR扩增反应体系的终浓度组成为：1～10×PCR缓冲液、0.1～1mM dNTPs、0.1～1uM目的基因甲基化正义链的引物对、0.1～1uM目的基因甲基化反义链的引物对、0.05～2ng/ul模板DNA、0.1～1uM目的基因甲基化正义链探针、0.1～1uM目的基因甲基化反义链探针、0.01～0.10U/ul TaqDNA聚合酶、1～5mM氯化镁，0.1～1uM内参基因甲基化引物对，0.1～1uM内参基因甲基化探针。

根据本发明的一方面，还提供了一种基因甲基化检测方法，目的基因为HOXA9基因，

目的基因HOXA9甲基化正义链的正向引物序列如SEQ No.10：

5’-TTATTGTTTTGTTGGACGGGTACG-3’

目的基因HOXA9甲基化正义链的反向引物序列如SEQ No.11：

5’-AATTTCATATAACAACTTAATAACACCG-3’

目的基因HOXA9甲基化反义链的正向引物序列如SEQ No.12：

5’-CGTTCGCGTTTTTATTGGTC-3’

目的基因HOXA9甲基化反义链的反向引物序列如SEQ No.13：

5’-CGAACCATTAATAACGTACGAA-3’

目的基因HOXA9甲基化正义链探针序列如SEQ No.14：

5’-AAATTACCGACGCCCGCG-3’

目的基因HOXA9甲基化反义链探针序列如SEQ No.15：

5’-AAACGAACACGTAACGCG-3’；

根据本发明的一方面，还提供了一种直肠癌检测方法，使用上述的基因甲基化检测方法检测目的基因甲基化程度判断是否患有直肠癌；

根据本发明的一方面，还提供了一种基因甲基化检测试剂盒，包含目的基因甲基化正义链的正向引物、目的基因甲基化正义链的反向引物、目的基因甲基化反义链的正向引物、目的基因甲基化反义链的反向引物、目的基因甲基化正义链探针和目的基因甲基化反义链探针；

根据本发明的一方面，还提供了一种基因甲基化检测试剂盒，

目的基因甲基化正义链的正向引物序列如SEQ No.1：

5’-TCGTTGTTTATTAGTTATTATG-3’，

所述目的基因甲基化正义链的反向引物序列如SEQ No.2：

5’-TCCGAAATAATCCCATCCCAT-3’，

所述目的基因甲基化反义链的正向引物序列如SEQ No.3：

5’-TTCGAAATGATTTTATTTAGTTG-3’，

所述目的基因甲基化反义链的反向引物序列如SEQ No.4：

5’-CGCTACCCACCAACCATC-3’，

所述目的基因甲基化正义链探针序列如SEQ No.5：

5’-TAACCGCGAAATCCGACATA-3’，

所述目的基因甲基化反义链探针序列如SEQ No.6：

5’-TATACCGAACCCCGCGATCA-3’，上述的目的基因为septin9。

根据本发明的一方面，还提供了一种基因甲基化检测试剂盒，

目的基因甲基化正义链的正向引物序列如SEQ No.10：

5’-TTATTGTTTTGTTGGACGGGTACG-3’

目的基因甲基化正义链的反向引物序列如SEQ No.11：

5’-AATTTCATATAACAACTTAATAACACCG-3’

目的基因甲基化反义链的正向引物序列如SEQ No.12：

5’-CGTTCGCGTTTTTATTGGTC-3’

目的基因甲基化反义链的反向引物序列如SEQ No.13：

5’-CGAACCATTAATAACGTACGAA-3’

目的基因甲基化正义链探针序列如SEQ No.14：

5’-AAATTACCGACGCCCGCG-3’

目的基因甲基化反义链探针序列如SEQ No.15：

5’-AAACGAACACGTAACGCG-3’，上述的目的基因为HOXA9。

根据本发明的一些方面，还提供了一类基因甲基化检测试剂盒，目的基因甲基化正义链探针、目的基因甲基化反义链探针5'端报告荧光基团为FAM，目的基因甲基化正义链探针、目的基因甲基化反义链探针3'端的猝灭基团为BHQ1；

根据本发明的一方面，还提供了一种基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含内参基因甲基化的引物对和内参基因甲基化探针，所述内参基因为ACTB，

内参基因引物序列如SEQ No.7：

ACTB-F:5’-GAATTTGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGT-3’，

所述内参基因引物序列如SEQ No.8：

ACTB-R:5’-CCTACTCCTCCCTTAAAAATTACAA-3’，

所述内参基因甲基化探针序列如SEQ No.9：

ACTB-probe:5’-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’

根据本发明的一方面，还提供了一种基因甲基化检测试剂盒的应用，基因甲基化检测试剂盒用于直肠癌检测。

本发明的整体思路如下：

本发明主要解决的技术问题是提供一种可以提高基因甲基化检测灵敏度的方法，该检测方法充分利用基因甲基化的两条链，操作简便、特异性强且检测灵敏度高。

本发明采用的一个技术方案是：利用双链检测提高基因甲基化检测的灵敏度，本发明的方法中包含目的基因甲基化正义链的引物对和目的基因甲基化反义链的引物对，作为衡量标准的内参基因ACTB甲基化的通用引物对和探针，以及检测目的基因甲基化的正、反义链的两条探针。

本发明的一个目的基因为septin9基因；septin9甲基化位点为启动子区的CpG岛，序列为转录起始位点上游的-670～-555bp区。针对该位点，本发明设计的目的基因甲基化正、反义链的引物对序列如下所示。

目的基因甲基化正义链的正向引物：5’-TCGTTGTTTATTAGTTATTATG-3’；

目的基因甲基化正义链的反向引物：5’-TCCGAAATAATCCCATCCCAT-3’；

目的基因甲基化反义链的正向引物：5’-TTCGAAATGATTTTATTTAGTTG-3’；

目的基因甲基化反义链的反向引物：5’-CGCTACCCACCAACCATC-3’；

本发明的septin9甲基化基因的正、反义链探针5'端报告荧光基团为FAM，septin9甲基化基因的正、反义链探针3'端的猝灭基团为BHQ1。针对septin9甲基化位点设计的检测目的基因甲基化正、反义链的两个探针序列如下所示。

目的基因甲基化正义链探针序列：5’-TAACCGCGAAATCCGACATA-3’；

目的基因甲基化反义链探针序列：5’-TATACCGAACCCCGCGATCA-3’；

本发明的内参ACTB甲基化基因的引物对和探针，序列如下：

ACTB-F:5’-GAATTTGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGT-3’

ACTB-R:5’-CCTACTCCTCCCTTAAAAATTACAA-3’

ACTB-probe:5’-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’

本发明所述的方法还包括其他PCR扩增的常规试剂，主要包括：DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、PCR buffer等。所述PCR扩增反应体系的终浓度组成为：1～10×PCR缓冲液、0.1～1mM dNTPs、0.1～1uM septin9甲基化正义链引物对、0.1～1uM septin9甲基化反义链引物对、0.1～1uM ACTB甲基化通用引物对、0.05～2ng/ul模板DNA、0.1～1uM septin9甲基化正义链探针、0.1～1uM septin9甲基化反义链探针、0.1～1uM ACTB甲基化通用探针、0.01～0.10U/ul TaqDNA聚合酶、1～5mM氯化镁。

本发明的一种检测步骤如下：

(1)从待测样本中提取DNA。

(2)将提取后的DNA进行硫化转化修饰。

(3)对修饰后的DNA进行纯化，得到样本模板。

(4)对样本模板进行PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性20分钟，聚合酶链式反应扩增阶段，95℃变性20s，56℃退火35s，并进行50个循环。

(5)比对正、反义双链荧光累积法中septin9基因CP值和单用一条链检测septin9基因的CP值，或者比对双链检测法和单链检测法中肠癌样本septin9基因甲基化的阳性检出率判断两种检测方法样本模板中甲基化的检测程度。以内参基因ACTB的扩增曲线和CP值判断实验的准确性和有效性。

本发明使用的DNA提取试剂和DNA硫化转化试剂均为苏州工业园区为真生物医药有限公司自主生产的试剂，提取及硫化试剂对外销售。

本发明首次使用同一基因的两条链，即正、反义链甲基化荧光累积方法提高基因甲基化检测灵敏度。与现有的甲基化检测技术相比，本发明中的利用双链检测基因甲基化程度的方法具有较高的基因甲基化检测灵敏度的优点，本发明方法充分利用DNA的两条链，增加荧光信号值，使甲基化荧光双重累积，提高基因甲基化的检测灵敏度，能在(95％)非甲基化DNA存在的背景下检测到目的基因的甲基化，即甲基化DNA含量仅为5％时本发明的方法也能准确检出。本发明方法采用定性法即可区分甲基化程度高低，根据扩增曲线和Cp值即可区分甲基化程度高低。除此之外，本发明的利用双链检测提高基因甲基化检测灵敏度的方法还具有以下优点：(1)检测过程为闭管同孔反应，即在一个孔中可同时检测到两条链的甲基化情况，操作简单快速，减少污染的可能性；(2)双重反应：目的基因与内参基因处于不同的荧光通道，通过内参基因可对整个实验的准确性和有效性进行监测和评估。(3)安全，整个体系不包含有毒有害物质，无需PCR产物的开管，对试验人员以及环境都无危害。

本发明根据该双链检测法发明了相关的试剂盒，同时优化了PCR扩增条件，进一步提高了扩增反应效率。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明的原理示意图；

图2为在1例肠癌血浆样本中使用本发明和常规方法的对比结果图；

图3为使用本发明检测甲基化灵敏度的实验结果图；

图4为使用本发明检测1例肺癌血浆样本(三个复孔)的检测扩增结果图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

材料：待检血浆样本、浓度为2ng/ul的甲基化阳性DNA、浓度为2ng/ul的甲基化阴性DNA。

仪器：Lightcycler 480、旋转混匀器、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱。

试剂：DNA聚合酶(罗氏公司)、10×PCR Buffer(罗氏公司)、MgCl₂(罗氏公司)、dNTP(TaKaRa)、纯化水。

引物和探针：所有引物的纯度应达到电泳级(PAGE)或HPLC级，不含杂带。所有探针5'端报告荧光基团为FAM，3'端的猝灭基团为BHQ1。所有引物和探针的序列由本发明研究人员自主设计，然后由供应商提供，浓度为10μmol/L备用。

septin9甲基化正义链的正向引物序列如SEQ No.1：

5’-TCGTTGTTTATTAGTTATTATG-3’

septin9甲基化正义链的反向引物序列如SEQ No.2：

5’-TCCGAAATAATCCCATCCCAT-3’

septin9甲基化反义链的正向引物序列如SEQ No.3：

5’-TTCGAAATGATTTTATTTAGTTG-3’

septin9甲基化反义链的反向引物序列如SEQ No.4：

5’-CGCTACCCACCAACCATC-3’；

septin9甲基化正义链探针序列如SEQ No.5：

5’-TAACCGCGAAATCCGACATA-3’

septin9甲基化反义链探针序列如SEQ No.6：

5’-TATACCGAACCCCGCGATCA-3’。

使用内参基因甲基化的引物对和内参基因甲基化探针，内参基因为ACTB，

内参基因引物序列如SEQ No.7：

ACTB-F:5’-GAATTTGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGT-3’，

内参基因引物序列如SEQ No.8：

ACTB-R:5’-CCTACTCCTCCCTTAAAAATTACAA-3’，

内参基因甲基化探针序列如SEQ No.9：

ACTB-probe:5’-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’。

对待测样本进行处理，所述待测样本为正常人血浆或肠癌血浆。

A.从待测样本中提取DNA(苏州为真公司)。

B.对提取的DNA进行硫化转化修饰(苏州为真公司)。

C.对修饰后的DNA进行纯化，得到样本模板。

将自主设计的septin9正义链引物对和正义链探针、反义链引物对和反义链探针以及DNA模板、内参基因甲基化的引物对和内参基因甲基化探针同时加到同一孔中进行PCR扩增反应。

PCR反应体系和条件

PCR扩增反应体系的终浓度组成为：1×PCR缓冲液、0.25mM dNTPs、350nM septin9甲基化正义链引物对、350nM septin9甲基化反义链引物对、0.05ng/ul模板DNA、70nM septin9甲基化正义链探针、70nM septin9甲基化反义链探针、1.5U TaqDNA聚合酶、2.5mM氯化镁。

PCR扩增反应的具体过程为：95℃预变性20分钟，聚合酶链式反应扩增阶段，95℃变性20s，56℃退火35s，并进行50个循环。若有扩增信号，且呈S型扩增曲线，则为阳性样本，说明有甲基化出现；若无扩增曲线升起，说明为阴性样本，即未发生甲基化。扩增的Cp值小于等于40时，结果为有效值。

收集北京协和医院结直肠癌血浆87例，健康人血浆107例。用上述双链检测法对血浆样本进行septin9基因甲基化检测，以QIAGEN公司的血浆游离DNA提取、硫化纯化试剂盒的单链检测法检测septin9基因甲基化作对比实验。统计检测结果，所有血浆样本的内参基因ACTB均有扩增且Cp值均小于40，证明该实验准确有效。观察目的基因通道，87例结直肠癌血浆样本，双链检测法检出阳性的为67例，阳性符合率为77.01％；单链检测法检出的阳性为59例，阳性符合率为67.82％。对阴性样本进行分析，107例健康人血浆样本，双链检测法中9例检测结果为阳性，阴性符合率为91.59％；单链检测法中4例检测结果为阳性，阴性符合率为96.26％。图2为其中1例肠癌血浆样本的两种检测方法的对比结果，如图所示，双链检测法检出的septin9基因甲基化的Cp值(曲线1)为29.71，荧光值为33左右；单链检测法检出的septin9基因甲基化的Cp值(曲线2)为33.37，荧光值为18左右。由此可见，双链检测法比单链检测法检出的septin9基因甲基化的Cp值高1-2个，且双链检测法检出的荧光值也是单链检测法检出的2倍。

将甲基化阳性DNA和甲基化阴性DNA稀释成相同浓度，即2ng/ul，分别在95％、85％、50％、30％的非甲基化DNA存在的背景下，用双链检测法检测含量为5％、15％、50％、70％的甲基化DNA，所有检测样本的内参基因ACTB均有扩增且Cp值均小于40，证明该实验准确有效。进而观察目的基因通道，统计检测结果如图3所示，曲线1为甲基化含量为70％的扩增曲线，CP值为23.90；曲线2为甲基化含量为50％的扩增曲线，CP值为25.23；曲线3为甲基化含量为15％的扩增曲线，CP值为26.71；曲线4为甲基化含量为5％的扩增曲线，CP值为27.28，根据结果可得，双链检测法能在(95％)非甲基化DNA存在的背景下检测到目的基因的甲基化，可大大的提高甲基化检测灵敏度。

当基因甲基化程度不高，样本中目的基因甲基化的Cp值超过40时，单链检测法定义为阴性，而此时双链检测法可充分利用两条链，累积甲基化荧光，增加甲基化的检出，从而提高目的基因甲基化的灵敏度和甲基化阳性检出率。

实施例2

发明人还做了HOXA9基因甲基化的双链检测。

正义链的探针：AAATTACCGACGCCCGCG

正义链的正向引物：TTATTGTTTTGTTGGACGGGTACG

正义链的反向引物：AATTTCATATAACAACTTAATAACACCG

反义链的探针：AAACGAACACGTAACGCG

反义链的正向引物：CGTTCGCGTTTTTATTGGTC

反义链的反向引物：CGAACCATTAATAACGTACGAA

检测20例肺癌血浆样本和13例健康人血浆样本。用上述双链检测法对血浆样本进行HOXA9基因甲基化检测。所有血浆样本的内参基因ACTB均有扩增且Cp值均小于40，证明该实验准确有效。观察目的基因通道，统计检测结果，所有血浆样本的内参基因ACTB均有扩增且Cp值均小于40，证明该实验准确有效。观察目的基因通道，20例肺癌血浆样本，双链检测法检出阳性的为15例，阳性符合率为75％；对阴性样本进行分析，13例健康人血浆样本，双链检测法中1例检测结果为阳性，阴性符合率为92.31％。图4为其中1例肺癌血浆样本(三个复孔)的检测扩增结果图。由此可见，双链检测法不仅适用于septin9基因甲基化的检测，对肺癌标志物HOXA9基因的甲基化检测也有较高的检出灵敏度和特异性。

<110> 江苏为真生物医药技术股份有限公司

<120> 基因甲基化检测方法和检测试剂盒及其应用

<160> 15

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 1

tcgttgttta ttagttatta tg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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tccgaaataa tcccatccc at 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ttcgaaatga ttttatttag ttg 23

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<212> DNA

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cgctacccac caaccatc 18

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<212> DNA

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taaccgcgaa atccgacata 20

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<212> DNA

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gaatttgtgt ttgttattgt gtgttgggt 29

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ttattgtttt gttggacggg tacg 24

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