一种巯嘌呤甲基转移酶酶活力检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，同时又属于临床诊断和检测领域。具体而言本发 明提供了 一种检测疏噪呤甲基转移酶（TPMT，thiopurine S_me thyltransferase，EC 2 · 1 · 1 · 67)酶活力的组合产品。
【背景技术】
[0002] 巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)是一种专门催化芳香族和杂环化合物的巯基甲基化 反应的胞内酶，该酶以S-腺苷-L-甲硫氨酸作为甲基供应者，催化芳香族和杂环化合物的硫 原子甲基化。
[0003] TPMT最初是在鼠的肾脏和肝脏中发现的，后来发现在多数组织中均有分布，如心、 血细胞、胎盘、胰腺、小肠等，而且在人的这些组织及红细胞中也发现了 TPMT JPMT结构和生 物活性具有多态性。人类红细胞内TPMT活性与肝、肾、白细胞、急性淋巴母细胞性白血病的 淋巴细胞的TPMT活性是呈正相关的，因而红细胞成为测定TPMT最容易得到的组织。根据 Klemetsdal的报道，不同人种红细胞的TPMT活性存在差异，如挪威北部莎弥人的TPMT活性 高于该地区非莎弥的白种人;在美国佛罗里达州，黑人的TPMT活性比白人低33%，但黑人和 白人中高活性、中等活性的比例是一致的;新加坡华人的TPMT活性高于美国人。随着分子生 物学技术的发展，现已发现TPMT基因存在多态性，该基因突变与酶缺陷存在密切关系。如在 TPMT缺陷的病人中发现的第一种突变(称为TPMT 2)是第80位密码子改变，即发生了G238- C颠换，由此导致丙氨酸80-脯氨酸，使TPMT活性上百倍地下降；发现的另一种突变（称为 TPMT 3)是在TPMT的0RF出现了两个核苷酸的转换，即G460-A和A719-G，导致相应的氨基 酸由丙氨酸154-苏氨酸和酪氨酸240-半胱氨酸，使细胞内TPMT蛋白的含量下降，可比野 生型低400倍，从而导致该酶缺陷。
[0004] 巯基嘌呤类药物在临床上已使用多年，主要用于白血病和肿瘤的化疗、器官移植 受者的免疫抑制治疗以及自身免疫性疾病的治疗。常用的药物为6-巯基嘌呤(MP)、6-硫鸟 嘌呤(TG)和咪唑硫嘌呤(AT) JP用于治疗急性淋巴母细胞白血病(ALL)已40多年，至今仍是 ALL治疗方案中不可缺少的药物。而AT则已成为免疫抑制治疗的三联药物之一，已广泛用于 肾移植病人。近来报道还可用于治疗自身免疫性肝炎且效果良好。
[0005] TPMT活性与临床上使用的巯基嘌呤类药物的代谢有重要关系。巯基嘌呤类药物在 体内的代谢主要有两条途径，一是在TPMT的催化下使硫基甲基化，二是在黄嘌呤氧化酶的 作用下氧化成硫尿酸。由于造血组织中缺乏黄嘌呤氧化酶，该组织中的嘌呤类药物主要靠 TPMT催化分解，因而TPMT缺陷的病人，如果使用了常规剂量的MP、AT和TG时，则会引起巯基 嘌呤类药物在体内堆积，而且主要影响造血系统，轻者引起中毒和影响治疗效果，重者可致 死亡。因此在接受巯基嘌呤类药物治疗之前进行TPMT的酶活力检测或者相关基因检测具有 重要意义，通过检测可以及时发现此类患者并积极调整剂量实现安全有效的治疗。
[0006] 目前ΤΡΜ?1酶活力检测的方法有两种，较常用的是非螯合的放射化学法（简称放射 化学法）。放射化学法测定TPMT活性的基本原理是利用该酶的转甲基作用，以14C标记的S- 甲基14C-腺苷-甲硫氨酸（14-SAM)为标记甲基的供者，在RBC溶解物中TPMT的催化下使MP接 受14C标记的甲基，再以液体闪烁计数测定DPM值，最后计算TPMT活力。另一种是HPLC法检测 TPMT活性，原理与放射法相同，最终通过HPLC检测MMP或类似物的含量反馈TPMT的活力。综 合上述两种检测方法来看，放射法的前期处理较复杂，对技术要求较高且易造成污染，而 HPLC法对设备要求较高，操作相对复杂，检测周期也较长;上述两种方法的特点均不利于推 广使用。
【发明内容】
[0007] 因此，基于上述已有技术的缺陷，为了解决现有巯嘌呤甲基转移酶（TPMT， thiopurine S_methyltransferase，EC 2· 1 · 1.67)的酶活力检测方法不易推广的问题，本 发明的目的是提供一种快速、特异、准确可靠的检测巯嘌呤甲基转移酶(TPMT，thiop Urine S-methyltransferase，EC 2.1.1.67)酶活力的组合产品。采用该组合产品可以在半自动或 全自动的分析检测设备上使用，而且检测灵敏度高，特异性高，操作简便，因而可以得到切 实的推广使用。
[0008] 针对上述发明目的，本发明是通过下述技术方案实现的：
[0009] 具体地，本发明提供了一种检测巯嘌呤甲基转移酶(TPMT)酶活力的组合产品，所 述组合产品含有：S-腺苷-L-甲硫氨酸或生成S-腺苷-L-甲硫氨酸的酶反应系统，所述生成 S-腺苷-L-甲硫氨酸的酶反应系统包括三磷酸腺苷，甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸合成酶；甲 基受体;S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶;优选地，所述组合产品为试剂盒形式，其中各包含 成分为各自独立存在的试剂状态。
[0010] 优选地，根据前述检测TPMT酶活力的组合产品，其中，所述甲基受体选自带巯基的 芳香族和带巯基的杂环化合物中的一种或两种;优选地，所述甲基受体选自巯基嘌呤、巯基 嘌呤类似物和巯基嘌呤衍生物中的一种或多种;更优选地，所述甲基受体选自巯基嘌呤、咪 唑硫嘌呤、6-硫鸟嘌呤、6-硫鸟嘌呤核苷酸、硫肌苷单磷酸盐、硫肌苷三磷酸盐、2-硫尿嘧 啶、2-硫胸腺嘧啶、巯基乙醇、溴苯硫酚、邻氨基苯硫醇、氯苯硫酚、氟苯硫酚、硫代苯甲酸和 巯基嘌呤核苷酸中的一种或多种。最优选为6-硫鸟嘌呤。
[0011]更优选地，根据前述的检测TPMT酶活力的组合产品，其中，所述组合产品还包括缓 冲液。所述缓冲液是被物理、化学和酶学上普遍接受的能将体系的pH值缓冲或稳定5.0~ 9.0的范围中的试剂，它的存在可以有效的稳定巯嘌呤甲基转移酶的催化反应的pH值，并可 以稳定巯嘌呤甲基转移酶的物化性质，从而利于巯嘌呤甲基转移酶的酶活力的分析和检 测。它包括以下实例但不限于这些实例：
[0012] 乙酸钠/乙酸:pH 2.6~5.8 [0013] 梓檬酸/梓檬酸钠:pH 3.0~6.6
[0014] 磷酸氢盐/柠檬酸(盐）:？!12.2~8.0
[0015] 磷酸盐:pH 4.9~8.2
[0016] 柠檬酸/氢氧化钠/盐酸:pH 2.2~6.5
[0017] 2-吗啉代乙磺酸缓冲液(腿5)卬!15.5~6.7
[0018] 3-吗啉丙磺酸缓冲液(MOPS) :pH 6.5~7.9
[0019] 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES):pH 6.8~8.2
[0020] Tris-盐酸：pH 7.1~8.9 [0021 ] 硼酸-硼砂缓冲液:pH 7.4~9.0 [0022]最优选为磷酸钾缓冲液。
[0023]再优选地，根据前述的检测TPMT酶活力的组合产品中，其中，所述组合产品pH范围 为5.0~9.0，优选为6.5~8.0，最优选为7.5。所述缓冲液为10~1000mmol/L，优选为25~ 100mmol/L，最优选为30mmol/L。所述甲基受体为0.002~10mmol/L，优选为0.05~0.5mmol/ L，最优选为0.2mmol/L。所述S-腺苷-L-甲硫氨酸为0.02~2mmol/L，优选为0.05~0.5mmol/ L，最优选为0 . lmmo 1 /L;及所述S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶为0.01~100KU/L，优选为 0.1 ~50KU/L，最优选为 10KU/L。
[0024] 优选地，根据前述的检测TPMT酶活力的组合产品中，其中，所述组合产品还含有试 剂，所述试剂为油酸、胆酸盐、Tween 20、Brij35或牛磺胆酸钠。优选地，所述试剂的体积百 分浓度为〇. 05-1 %。最优选为0.5 %。
[0025] 优选地，根据前述的检测TPMT酶活力的组合产品中，其中，所述组合产品为干粉或 液体。
[0026] 优选地，根据前述的检测TPMT酶活力的组合产品中，其中，所述组合产品为双剂试 剂或三剂试剂。
[0027] 具体地，根据前述的检测ΤΡΜ?1酶活力的组合产品中，其中，所述组合产品包括：
[0028] 缓冲液 丨0~1000mmol/L pH范围 5.0~9.0 甲基受体 0.002~10mmol/L SAM 0.02 ~2mmol/L.. S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶 0.01~100KU/L
[0029] 实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是双 剂还是三剂，如下成分关系较为理想。
[0030] 因此，优选地，根据前述的检测ΤΡΜ?1酶活力的组合产品，其中，所述组合产品包括：
[0031] 缓冲液. 25~丨00mmol/L pi-1 范围 6.5 ~8.0 甲基受体 0.05~0.5mniol/L SAM 0.05 ~0.5mmo:l/L. S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶 0.1~50KU/L
[0032]最优选地，根据前述检测TPMT酶活力的组合产品，其中，所述组合产品pH为7.5,所 述组合产品含有所述缓冲液30mmo 1/L，所述甲基受体0.2mmo 1/L，所述SAMO. lmmo 1/L，所述 S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶10KU/L。所述缓冲液为磷酸钾缓冲液，所述甲基受体为6-硫 鸟嘌呤。
[0033]本发明所述的检测ΤΡΜ?1酶活力的组合产品，可以配成如下双剂试剂：
[0034] 试剂 1
[0035] 缓冲液、SAM
[0036] 试剂2
[0037] 缓冲液、甲基受体