专利名称：定性检测tpmt基因亚型的测序引物对及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及体外核酸检测领域，尤其涉及一种在临床样本中区分TPMT基因中的*3A/3B/3C基因亚型的测序引物对及其试剂盒。
背景技术：
疏嘌呤甲基转移酶TPMT (thiopurine S-methyltransferase, TPMT),是一种胞衆酶，广泛分布于肝、肾、心、脑、肺、骨骼肌及血细胞组织中，主要催化芳香及杂环类巯基化合物的S-甲基化反应。巯嘌呤类药物，如6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤和硫唑嘌呤，在临床上作为抗肿瘤药用于急性白血病的治疗，或作为免疫抑制剂广泛应用于器官移植、炎性肠病等的治疗。TPMT在这类药物的代谢过程中起着关键作用。巯嘌呤类药物的疗效和毒性均与患者体内的TPMT的酶活性有关。TPMT酶活性高的患者长期服用这类药会产生耐受性而且复发率很高，而TPMT酶活性低的患者服用常规剂量的巯嘌呤类药物后会发生严重的造血系 统毒性。TPMT的酶活性与其基因多态性相关，突变导致基因编码的蛋白水解增强、稳定性，迄今已发现20余种导致酶活性降低的突变。TPMT基因突变类型在不同种族间存在显著性差异。白种人最常见的突变类型是TPMT*3A，其次是TPMT*2和TPMT*3C，其中TPMT*2在其他人种中非常罕见。黑人中最常见的TPMT基因突变类型是TPMT*3C，其次是TPMT*3A。而亚洲人多为TPMT*3C，也检测到TPMT*3A。据文献显示，在汉族人群中，TPMT*3C是目前唯一被发现的突变型等位基因，且均为杂合子，突变频率约为I. 3%，这与日本人分布特征相似(亦仅发现TPMT*3C，等位基因频率I. 60%)。通过对患者基因分型检测，判定患者的TPMT酶活性，从而帮助医生正确选择药物并合理调整药物剂量，提高药物使用有效性，并降低毒副作用。焦磷酸测序技术是近年来发展起来的新一代DNA序列分析技术，它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测，既可进行DNA序列分析，又可进行基于序列分析的单核苷酸多态性检测及等位基因频率测定，突变检测，缺失和插入分析，CpG岛甲基化分析，细菌、病毒鉴定和分型，耐药性分析等，是一个理想的遗传分析技术平台。焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。其技术原理是引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATPsulfurytase).突光素酶(Iuciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase) 4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。目前市场上还没有利用焦磷酸技术进行TPMT基因分型的产品。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性高、准确性好、能够定性检测TPMT*3A/3B/3C基因亚型的测序引物对及其试剂盒。为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案一种检测TPMT基因亚型的测序引物对，所述引物对为如下引物TPMT 460 正向扩增引物5' -CAGCAGAGGGGACATGAAAT-3' (SEQ ID NO. I)；TPMT 460 反向扩增引物5' -CTTTGGAATGGCACAGGGTAC-3' (SEQ ID NO. 2)TPMT 460 测序引物5' -CTTCAAGGTGTAAAATGC-3' (SEQ ID NO. 3)TPMT 719 正向扩增引物5' -TGAAAGTGAACTCCCTGCTACC-3' (SEQ ID NO. 4)TPMT 719 反向扩增引物5' -TCCACTGGGATCAACAGTATCTT-3' (SEQ ID NO. 5) TPMT 719 测序引物5' -CGCCCTCTCCTACTTA-3' (SEQ IDN0. 6)其中，TPMT460 反向扩增引物(SEQ ID NO. 2)和 TPMT 719 (SEQ ID NO. 6)反向扩增引物的5'端分别进行生物素标记。一种定性检测TPMT基因亚型的测序试剂盒，所述试剂盒包括含有SEQ ID NO. I所示正向扩增引物的PCR反应液1，含有SEQ IDN0. 4所示正向扩增引物的PCR反应液2，SEQID NO. 2和SEQ ID NO. 5所示的反向扩增引物，SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 6所示的测序引物；其中，SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 5所示引物的5’端进行生物素标记。进一步地，所述试剂盒中还包括质控品TAYGGTTTGCA (SEQ ID NO. 7) (controloligo)和作为空白对照品的超纯水；质控序列是由QIAGEN设计合成的一段寡聚核苷酸链，用于检测PyroMark Q24测序仪的各项性能指标。进一步地，所述试剂盒还包括TPMT 460阳性对照品1，TPMT 460阳性对照品2，TPMT 460阳性对照品3 ；TPMT 719阳性对照品I，TPMT 719阳性对照品2，TPMT 719阳性对照品3 ;所述TPMT 460阳性对照品I为插有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的TPMT460野生纯合子质粒；所述TPMT 460阳性对照品2为插有SEQ ID NO. 9所示核苷酸序列的TPMT460突变纯合子质粒；TPMT 460阳性对照品3为由所述TPMT 460突变纯合子质粒和所述TPMT 460野生纯合子质粒组成的TPMT 460质粒混合物；所述TPMT 719阳性对照品I为插有SEQ ID NO. 10所示核苷酸序列的TPMT719野生纯合子质粒；TPMT 719阳性对照品2为插有SEQ ID NO. 11所示核苷酸序列的TPMT 719突变纯合子质粒；TPMT 719阳性对照品3为由所述TPMT 719突变纯合子质粒和所述TPMT719野生纯合子质粒组成的TPMT 719质粒混合物；其中，质粒载体为pMD18-T质粒；所述TPMT 460质粒混合物中TPMT 460突变纯合子质粒和所述TPMT 460野生纯合子质粒的数量比为I: I ;所述TPMT719质粒混合物中TPMT719突变纯合子质粒和所述TPMT 719野生纯合子质粒的数量比为1:1。所述的PCR反应液I和PCR反应液2中其他组分为常规的IOxPCR Buffer、dNTP和H2O,各组分按常规体积比配置(IOxPCR Buffer、dNTP、H2O和反应液中引物的体积比为5:3:37. 5:1)。试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂，如由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶组成的酶混合物，由5’-磷酰硫酸和荧光素组成的底物混合物，尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。本发明的优点及有益效果
I)本发明提供的定量检测TPMT基因亚型的焦磷酸测序试剂盒定性准确，具有灵敏性高、特异性强的优点，样品处理简单，测序速度快，高通量，半个小时完成一次上机反应，直接给出检测位点频率分析，结果直观。2)本发明提供的定量检测TPMT基因亚型的焦磷酸测序试剂盒灵敏度和特异性闻;3)本发明提供的定量检测TPMT基因亚型的焦磷酸测序试剂盒检测速度快；4)本发明提供的定量检测TPMT基因亚型的焦磷酸测序试剂盒步骤简单；5)本发明提供的定量检测TPMT基因亚型的焦磷酸测序试剂盒可同时进行高通量的样本检测。6)本发明的试剂盒中设置了空白对照和阳性对照，能更好的确保检测结果的准确·性。由于设计了灵敏度高，特异性好的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒能够对TPMT基因亚型进行快速检测。本发明的试剂盒可实时监测反应进程，反应时间短，PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序，操作简便，反应时间短，高通量，比金标准——毛细管电泳测序灵敏度高，更适合用于突变分析。
图I为临床TPMT 460野生纯合子的焦磷酸测序图；图2为临床TPMT 719杂合子的焦磷酸测序图；图3为临床质控品control oligo的焦磷酸测序图；图4为临床空白对照的焦磷酸测序图。图5多组设计引物的凝胶电泳图；图中①、②表明非特异性条带，③表明特异性和片段大小均比较合适，④表明目的带片段大小不对。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例I :试剂盒的制备I.引物和探针的设计与合成使用PyroMark Assay Design2. O软件，针对TPMT的7号外显子和10号外显子以及中间的内含子区域，研究表明汉族人中目前针对TPMT基因分型主要集中在*3A/3B/3C中(William ZF et al. J Gastrointestin Liver Dis. 2011;20(3). 247-253. Shuta U etal. Pharmacogenetics and Genomics. 2008;18. 887-893. William EE et al. Journal ofClinical Oncology. 2001;19(8). 2293-2301. Oreste E et al. Pharmacogenetics and
Genomics. 2005; 15. 801-815.)，选择特异的突变位点-TPMT G460A、A719G，其中扩增引
物和测序引物先经过PAGE纯化，再经HPLC纯化，其中扩增引物其中一条在5’端加上生物
^己O扩增序列如表I :
表I.特异性扩增引物与测序引物序列
权利要求
1.一种定性检测TPMT基因分型的测序引物对，其特征在于，所述引物对为SEQ IDNO. I和SEQ ID NO. 4所示的正向扩增引物，SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 5所示的反向扩增引物，SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 6 所示的测序引物；其中，SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 5 PJf示引物的5’端进行生物素标记。
2.一种定性检测TPMT基因分型的测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有SEQID NO. I所示正向扩增引物的PCR反应液1，含有SEQ ID NO. 4所示正向扩增引物的PCR反应液2，SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 5所示的反向扩增引物，SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 6所示的测序引物；其中，SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 5所示引物的5’端进行生物素标记。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括SEQID NO. 7所示的质控品和空白对照品。
4 权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述空白对照品为水。
5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括TPMT460阳性对照品1，TPMT 460阳性对照品2，TPMT 460阳性对照品3 ；TPMT 719阳性对照品1，TPMT719阳性对照品2，TPMT 719阳性对照品3 ； 所述TPMT 460阳性对照品I为插有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的TPMT 460野生纯合子质粒；所述TPMT 460阳性对照品2为插有SEQ ID NO. 9所示核苷酸序列的TPMT460突变纯合子质粒；TPMT 460阳性对照品3为由所述TPMT 460突变纯合子质粒和所述TPMT460野生纯合子质粒组成的TPMT 460质粒混合物； 所述TPMT 719阳性对照品I为插有SEQ ID NO. 10所示核苷酸序列的TPMT 719野生纯合子质粒；TPMT 719阳性对照品2为插有SEQ ID NO. 11所示核苷酸序列的TPMT 719突变纯合子质粒；TPMT 719阳性对照品3为由所述TPMT 719突变纯合子质粒和所述TPMT 719野生纯合子质粒组成的TPMT 719质粒混合物； 其中，质粒载体为PMD18-T质粒。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述TPMT460质粒混合物中TPMT 460突变纯合子质粒和所述TPMT 460野生纯合子质粒的数量比为1:1。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述TPMT719质粒混合物中TPMT 719突变纯合子质粒和所述TPMT 719野生纯合子质粒的数量比为1:1。
全文摘要
本发明提供一种定性检测TPMT基因亚型的测序引物对及其试剂盒，属于体外核酸检测领域，所述试剂盒包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR反应液、PCR扩增引物、焦磷酸测序引物、以及对照品；本发明提供的试剂盒灵敏度高，特异性好，PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序，操作简便，反应时间短，比金标准——毛细管电泳测序灵敏度高，更适合用于SNP分析。
文档编号C12Q1/68GK102899407SQ20121034832
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者陈艳 申请人:长沙三济生物科技有限公司