焦磷酸测序法检测cyp3a4基因分型的引物对及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及体外核酸检测技术领域，尤其设及一种焦憐酸测序法检测CYP3A4基 因分型的引物对及试剂盒。
【背景技术】
[0002] CYP450酶是一种重要的单氧化酶，在许多内源性及外源性化合物的氧化或还原代 谢中起重要作用，包括类固醇、脂肪酸、前列腺素、药物、致癌物质和毒素等。近年来，国外 已在人肝微粒体中发现近200种CYP450同工酶，其中，CYP3A4约占成肝CYP450酶总量的 25%，它参与了多种环境毒素及其常用化疗药物的代谢反应。
[0003] 迄今为止，在中国人中已发现的CYP3A4突变等位基因主要为内含子2、内含子10、 CYP3A4*3、CYP3A4*4、CYP3A4*5、CYP3A4*6、CYP3A4*18 (其中，CYP3A4*18B与CYP3A4*1G具有 同一突变位点20230G〉A)和CYP3A4*19。CYP3A4*1G(同CYP3A4*18B)是目前在中国人群中 发现的CYP3A4基因突变频率最高的一个位点，有文献报道该突变会提高CYP3A4酶活性。
[0004]CYP3A4酶参与多种阿片类药（如芬太尼、阿芬太尼、苏芬太尼、下丙诺啡及美沙酬 等）的代谢。芬太尼静脉给药后主要在肝脏经N-去径基化生成去甲芬太尼。研究表明， CYP3A4*1G与镇痛药物芬太尼代谢有密切关系，与术后24小时芬太尼静脉镇痛消耗量降低 有关。
[0005] 强效免疫抑制剂他克莫司（FK506)作为临床一线药物，因狭窄的治疗窗和显著 的个体差异，必须通过治疗药物监测及时调整用药剂量。FK506在体内主要经CYP3A4及 CYP3A5药物代谢酶代谢。编码CYP3A4及CYP3A5酶的基因存在许多单核巧酸多态性（single nucleotidepolymo;rphisms，SNP)，如果运些SNP位点为突变型，将影响患者FK506的代谢 过程和疗效。研究发现，CYP3A4*1G位点的基因型与他克莫司血药浓度及使用剂量、不良反 应和急性排斥反应相关。因此进行CYP3A4*1G位点的基因分型检测对于实现他克莫司的个 性化用药有着非常重要的意义。
[0006] 焦憐酸测序（Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序（即，确定DNA 中核巧酸的顺序）方法，属于新一代DNA序列分析技术，具备同时对大量样品进行测序分 析的能力，并具有高通量、特异性高、快速、直观及低成本的优点。其基本原理为，由4种酶 催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若 该dNTP与模板配对，聚合酶就可W将其渗入到引物链中并释放出等摩尔数的焦憐酸基团 (PPi),PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，每个峰值的高度 与反应中渗入的核巧酸数目成正比；然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成；最后通过分 析出峰值的情况，达到测定DNA序列的目的。不过，现有技术中还没有利用焦憐酸测序技术 检测CYP3A4基因分型的产品。
[0007] 目前，现有技术中，主要采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性 (PCR-RFLP)、手工或自动测序及序列特异性引物PCR等方法检测CYP3A4基因分型，运些方 法存在检测结果准确性不高、检测周期长及操作繁琐的缺点，难W满足临床检验的标准要 求。
【发明内容】
[0008] 为了解决上述方法检测CYP3A4基因分型过程中存在检测结果准确性不高、检测 周期长、操作繁琐及难W满足临床检验要求的技术问题，本发明提供一种检测结果准确、特 异性高、检测周期短、操作简单并有效满足临床检验要求的焦憐酸测序法检测CYP3A4基因 分型的引物对及试剂盒。
[0009] 本发明提供了一种焦憐酸测序法检测CYP3A4基因分型的引物对，所述CYP3A4基 因检测的多态性位点为CYP3A4*1G，所述引物对包括：
[0010]正向扩增引物：5' -GGAGGAAATTGATGCAGTTTTACC-3'（SEQIDNO. 1);
[0011]反向扩增引物：5' -ACGCTTCTGCCAGTAGCAA-3'（SEQIDNO. 2);
[001引 测序引物：5, -CCCTCCTTCTCCATGTA-3'（沈QIDNO. 3);
[0013] 其中，所述正向扩增引物的5'端进行生物素标记。
[0014] 本发明还提供了一种焦憐酸测序法检测CYP3A4基因分型的试剂盒，所述CYP3A4 基因检测的多态性位点为CYP3A4*1G，所述试剂盒包括：
[001 引 正向扩增引物：5' -GGAGGAAATTGATGCAGTTTTACC-3'（SEQIDNO. 1);
[0016]PCR反应液，所述PCR反应液含有反向扩增引物： 5' -ACGCTTCTGCCAGTAGCAA-3'(沈QIDNO. 2);
[0017]测序引物：5, -CCCTCCTTCTCCATGTA-3'（沈QIDNO. 3);
[0018] 其中，所述正向扩增引物的5'端进行生物素标记。
[0019] 在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括：
[0020]CYP3A4*1G阳性对照品1，其为插有沈QIDNO. 5所示核巧酸序列的CYP3A4*1G野 生纯合子质粒；
[0021]CYP3A4*1G阳性对照品2,其为所述CYP3A4*1G野生纯合子质粒与插有SEQID NO. 6所示核巧酸序列的CYP3A4*1G突变纯合子质粒组成的质粒混合物；
[0022] CYP3A4*1G阳性对照品3,其为插有沈QIDNO. 6所示核巧酸序列的CYP3A4*1G突 变纯合子质粒；
[0023] 其中，质粒载体为PMD18-T质粒；所述CYP3A4*1G阳性对照品2中所述CYP3A4*1G 突变纯合子质粒和所述CYP3A4*1G野生纯合子质粒的数量比为1:1。
[0024] 在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括：质控品 ((3〇11付〇1〇11旨〇)和空白对照品，所述质控品的序列为打4￥66口76〔4 669 10^.4);所 述空白对照品为水；质控品的序列是由QIAGEN设计合成的一段寡聚核巧酸链，用于检测 PyroMarkQ24测序仪的各项性能指标。
[002引所述PCR反应液还含有其他组份，分别为常规的10XPCRBuffer、dNTPS和&0,各 组分按常规体积比配置（10XPCRBuffer、dNTPs、H20及PCR反应液中反向扩增引物的体积 比为 5 :3 :37. 5 :1)。
[0026] 所述试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦憐酸测序的常规试剂，如由DNA聚 合酶、=憐酸腺巧硫酸化酶、巧光素酶和双憐酸酶组成的酶混合物，由5' -憐酷硫酸和巧光 素组成的底物混合物，尿喀晚DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。
[0027] 本发明还提供了如上所述的引物对在制备用于检测CYP3A4基因分型的试剂中的 应用。
[002引本发明还提供了如上所述的试剂盒在制备用于检测CYP3A4基因分型的试剂中的 应用。
[0029] 相较于现有技术，本发明提供的焦憐酸测序法检测CYP3A4基因分型的引物对及 试剂盒具有W下有益效果：
[0030] 一、通过利用焦憐酸测序法技术设计了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂 盒，使得所述试剂盒在检测CYP3A4*1G基因分型时，具有定性准确，灵敏度高及特异性强的 优点；此外，还具有样品处理简单、测序步骤简单、测序速度快、半个小时完成一次上机反 应、直接给出检测位点频率分析及结果直观的优点；
[0031] 二、通过利用焦憐酸测序法技术设计了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂 盒，使得所述试剂盒在检测CYP3A4*1G基因分型时，可实时监测反应进程、反应时间短、PCR 产物简单处理即可上焦憐酸测序仪测序、操作简便及高通量样品检测，并比金标准方法，即 毛细管电泳测序法灵敏度更高，更适合用于临床检验的要求；
[0032]S、通过在所述试剂盒中设置了空白对照品、阳性对照品和质控品，使得所述试剂 盒在检测CYP3A4*1G基因分型时，可W更好的确保检测结果的准确性。
【附图说明】
[0033] 图1为临床样品CYP3A4*1G野生型的焦憐酸测序图；
[0034] 图2为临床样品CYP3A4*1G突变杂合型的焦憐酸测序图；
[0035] 图3为临床样品CYP3A4*1G突变纯合