焦磷酸测序法检测eml4-alk融合基因的引物对及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基 因的引物对，包含所述引物对的试剂盒及该试剂盒的应用。
【背景技术】
[0002] 棘皮动物微管相关类蛋白 4(echinoderm microtubule-associated protein_like4，EML4)与间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK)融合基因 与2007年被日本学者发现存在于部分非小细胞肺癌（NSCLC)患者中，EML4-ALK融合基因在 NSCLC中的阳性率约为3% -4%左右。EML4-ALK融合基因包括多种变异体（variants)，其 中变异体l(variant 1或VI)和变异体3(variant 3或V3)的检出率最高。同时，EML4-ALK 抑制剂为肺癌的个性化治疗提供了新的途径。
[0003] 当前国内外广泛使用的分子生物学检测EML4-ALK融合基因的方法中，荧光原位 杂交技术（FISH)操作复杂，而且不能区分不同的变异体；荧光定量PCR存在着检测通量 的局限性和假阳性的缺点，所以都还不能真正满足临床诊断检测的需要。传统的固相生物 芯片（Biochip)或基因芯片技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐的突出弱 点。
[0004] 焦磷酸测序技术（Pyrosequencing)是新一代DNA序列分析技术，具备同时对大量 样品进行测序分析的能力，为高通量、低成本、快速、直观地进行核苷酸分析和临床检验提 供了非常理想的技术操作平台。
【发明内容】
[0005] 发明目的：针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出一种焦磷酸测序法检 测EML4-ALK融合基因的引物对以及含有所述引物对的试剂盒，可以同时检测EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3两种融合基因，具有高灵敏度、高特异性、高准确度、检 测迅速等优点。
[0006] 技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出了一种焦磷酸测序法检测EML4-ALK 融合基因的引物对，所述的EML4-ALK为EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3中的 任意一种或两种，其特征在于，所述引物对包括：
[0007] (1)对于 EML4-ALK variant 1 基因，
[0008] 扩增引物为：
[0009] 上游引物：5，-CACACCTGGGAAAGGACCTAAA-3，，
[0010] 下游引物：5，-CGGAGCTTGCTCAGCTTGTACT-3，，
[0011] 其中下游引物的5'端进行生物素标记；
[0012] 测序引物为：
[0013] 5' -TGGGAAAGGACCTAAA-3，；
[0014] (2)对于 EML4-ALK variant 3 基因：
[0015] 扩增引物为：
[0016] 上游引物：5，-TGCAGACAAGCATAAAGATGTCAT-3 '，
[0017] 下游引物：5，-TTGGGGTTGTAGTCGGTCAT-3'，
[0018] 其中上游引物的Y端进行生物素标记；
[0019] 测序引物：
[0020] 5， -GTGCTTCCGGCGGTA-3'。
[0021] 本发明进一步提出了一种焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基因的试剂盒，所述 的EML4-ALK为EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3中的任意一种或两种，其特征 在于，所述试剂盒包含质控品和如下引物：
[0022] (1)对于 EML4-ALK variant 1 基因，
[0023] 扩增引物为：
[0024] 上游引物：5，-CACACCTGGGAAAGGACCTAAA-3，，
[0025] 下游引物：5，-CGGAGCTTGCTCAGCTTGTACT-3，，
[0026] 其中下游引物的5'端进行生物素标记；
[0027] 测序引物为：
[0028] 5' -TGGGAAAGGACCTAAA-3，；
[0029] (2)对于 EML4-ALK variant 3 基因：
[0030] 扩增引物为：
[0031] 上游引物：5，-TGCAGACAAGCATAAAGATGTCAT-3 '，
[0032] 下游引物：5，-TTGGGGTTGTAGTCGGTCAT-3 '，
[0033] 其中上游引物的5'端进行生物素标记；
[0034] 测序引物：
[0035] 5' -GTGCTTCCGGCGGTA-3'。
[0036] 其中，所述质控品包括阳性对照品和阴性对照品；所述的阳性对照品为含有 EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3的质粒的混合液，所述的阴性对照品为不含 EML4-ALK variant 1 和 EML4-ALK variant 3 的质粒溶液。
[0037] 本发明还提出了上述引物对及包含上述引物对的试剂盒在制备检测EML4-ALK融 合基因的试剂中的应用。
[0038] 有益效果：与现有技术相比，本发明的焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基因的试 剂盒能够实现快速、简便、高效、准确的检测EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3 融合基因，为制备用于检测EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3融合基因的试剂 提供了理论基础。
【具体实施方式】
[0039] 实验材料：
[0040] 引物由Invitrogen公司合成；Trizol购自Invitrogen公司；逆转录cDNA合成试 剂盒购置于Fermentas公司；多重PCR试剂盒和焦磷酸测序试剂购置于QIAGEN公司。
[0041] 一种焦磷酸测序法检测EML4-ALK融合基因的试剂盒，所述的EML4-ALK为 EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3中的任意一种或两种，包括质控品和如下引 物：
[0042] (1)对于 EML4-ALK variant 1 基因，
[0043] 扩增引物为：
[0044] 上游引物：5，-CACACCTGGGAAAGGACCTAAA-3，，
[0045] 下游引物：5' -CGGAGCTTGCTCAGCTTGTACT-3'，
[0046] 其中下游引物的5'端进行生物素标记；
[0047] 测序引物为：
[0048] 5' -TGGGAAAGGACCTAAA-3，；
[0049] (2)对于 EML4-ALK variant 3 基因：
[0050] 扩增引物为：
[0051] 上游引物：5，-TGCAGACAAGCATAAAGATGTCAT-3 '，
[0052] 下游引物：5，-TTGGGGTTGTAGTCGGTCAT-3 '，
[0053] 其中上游引物的5'端进行生物素标记；
[0054] 测序引物：
[0055] 5' -GTGCTTCCGGCGGTA-3'。
[0056] 其中，质控品（质控品DNA)包括阳性对照品和阴性对照品；所述的阳性对照品为 含有EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3的质粒的混合液；所述的阴性对照品 作为阴性对照，与阳性对照品相比，阴性对照品为不含EML4-ALK variant 1和EML4-ALK variant 3的质粒溶液。
[0057] 检测方法包括如下步骤：
[0058] ( -）RNA 提取：
[0059] 取35个NSCLC患者的冰冻组织样本或石蜡包埋组织样本；1-35号患者的临床样 本分别按照下面的步骤提取RNA :
[0060] (1)将冷冻组织样本在液氮中磨成粉末后，再以每50~IOOmg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10% ;
[0061] (2)研磨液室温放置5分钟，然后以每1ml Trizol液加入0. 2ml的比例加入氯仿， 盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒；
[0062] (3)取上层水相于一新的离心管，按每ml Trizol液加 0. 5ml异丙醇的比例加入异 丙醇，室温放置10分钟，4°C下12, OOOg离心10分钟；
[0063] (4)弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少Iml的比例加入75 %乙醇，涡旋混匀， 4°C下8, OOOg离心5分钟；
[0064] (5)小心弃去上清液，然后室温晾干或真空干燥5-10min ;
[0065] (6)用 50ul RNase-free dH20 溶解 RNA 样品，55 ~60°C，5 ~IOmin ;
[0066] (7)测OD值定量RNA浓度。
[0067] 按照上述步骤，分别获得1~35号样本的mRNA。
[0068] (二）多重逆转录PCR扩增：
[0069] 按照如下方法对上述的1~35号样本的mRNA进行多重逆转录PCR扩增：
[0070] (l)cDNA第一链的合成
[0071] ①取一 RNase-free的离心管，置于冰上，建立下列反应体系；
[0072] Total RNA 5 ~ 10 μ g/3 μ I
[0073] Oligo (dT) 18Primer (0. 5 μ g/ μ I) I μ I
[0074] RNase-free dH20 加至 12 μ I
[0075] 轻轻混匀反应液，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；
[0076] ②离心管于70°C温育5分钟，之后迅速取出置于冰中冷却，用冷冻离心机稍微离 心收集管壁上的反应液到管底；
[0077] ③将离心管放置于冰上，按顺序加入以下反应液；
[0078] 5 Xreaction buffer 4 μ I
[0079] RNase Inhibitor(20U/μ I) I μ I
[0080] IOmM dNTPs Mix 2 μ I
[0081] 轻轻混匀反应液，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；
[0082] ④离心管于37°C温育5分钟；
[0083] ⑤加入 1 μ I RevertAidTM Reverse Transcriptase (200U/μ 1)，终体积为 20 μ 1 ;
[0084] ⑥离心管于42°C反应60分钟；
[0085] ⑦离心管于70°C加热10分钟终止反应，之后迅速取出置于冰中冷却。
[0086] 如此，合成 cDNA 第一链，即模板 cDNA(Template cDNA)。
[0087] (2)多重 PCR
[008