检测aml1-eto融合基因相对表达量的引物和方法

检测aml1-eto融合基因相对表达量的引物和方法
【专利摘要】本发明公开了检测AML1-ETO融合基因相对表达量的引物，包括（1）检测目的基因用上下游引物AML1-ETO-F，AML1-ETO-R，探针AML1-ETO-Probe，和（2）检测内参基因Abl用引物为abl-F，abl-R，探针abl-Probe。本发明还公开检测AML1-ETO融合基因相对表达量的方法，检测精度高，而且操作简单，可降低检测成本，节约检测时间。
【专利说明】检测AML1-ET0融合基因相对表达量的引物和方法
[0001]本申请是申请号为201210174382.0、申请日2012年5月30日的中国专利申请的
分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明属生命科学和生物【技术领域】，特别是一种基因检测试剂盒，采用探针实时荧光定量PCR技术，能够对人类急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者体内AMLl-ETO融合基因表达水平进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。
【背景技术】
[0003]在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)中染色体易位很常见，其中某些易位与AML的亚型有特异性的联系。在AML中t(8 ；21) (q22 ；q22)是最常见的染色体异常之一，可见于近40%的AML-M2亚型患者和8%~20%的原发AML患者。该易位导致21号染色体的AMLl基因(acutemyeloblastic leukemia one gene)和8号染色体的ETO基因(eight twenty-one gene，也称为 MTG8 基因)融合，形成 AML1-ET0 和 ET0-AML1 融合基因。由于后者不能通过聚合酶链式反应(PCR)方法检测到，一般认为其表达量极低或者由于降解导致表达不稳定。故现阶段的研究多集中AML1-ET0融合基因。AML1-ET0融合蛋白全长含有 752 个氨基酸,其 N 端为 RUNXl (runt-related transcription factor I),也称为AMLl、CBFct2或者PEBP2ctB区，含有结合DNA的结构域；C端为8号染色体编码的RUNXlTl[runt-related transcription factor I ;tran_located to,I(cyclin D-related)],也称为ETO(eight-twenty-one)。文献报道12% -20%的急性髓系白血病(AML)存在t (8 ；21) (q22 ；q22)染色体易位，尤其在AML-M2，其发生率可高达40% -80 %。研究证实，全长的AML1-ET0融合蛋白在小鼠动物实验中并无致白血病作用，而C末端截短倒位的融合蛋白(AMLl-ETOtr)却高度致白血病。Lancet等鉴定出一种具有选择性的剪接变构体AML1-ET0，它含有ETO外显子9a，产生的AMLl-ET09a融合蛋白几乎与AMLl-ETOtr完全相同，也有较强的致白血病作用。尽管目前为止尚未发现新的与AML1-ET0相同的结合位点，但与AMLl相t匕，AMLl ETO能够优先与包含重复的AMLl相同位点的DNA序列相结合，说明AML1-ET0融合蛋白具有优先选择具有多聚化AMLl相同位点的AMLl靶基因，可能是其阻断正常血细胞生成、促进白血病发生的机制之一。
[0004]有研究报道，融合蛋白AML1-ET0并非通过单一通路导致白血病的发生，它的作用可能是通过多方面、多因素、多步骤的影响，或者类似于信号通路级联放大作用，从而触动急性白血病的猝发。但染色体易位产生融合基因AML1-ET0是白血病发生的一个重要始动因素，没有它也就没有下游基因或染色体改变事件，因而也不会有白血病的发生。因而，对AML1-ET0融合基因进行定量监测，是判断和追踪该基因阳性的白血病患者疗效的良好指标，可以较好地反映患者微小残留病的动态变化。 [0005]目前临床上已经将AML1-ET0融合基因作为动态评估患者病情及预后的手段之一。常用的检测技术有荧光原位杂交技术(FISH)、RT-PCR、RQ-PCR等方法。FISH法尽管结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。而单纯RT-PCR法则为终点定量，无法对起始模板量进行准确的估算。此外，由于砷剂及全反式维甲酸的应用，APL治疗效果得到很大的提高，微小残留病是其复发的主要原因，因而急需一种高敏感性、高特异性、高自动化程度、污染控制好的方法来对AMLl-ETO融合基因mRNA残留进行检测。
[0006]RQ-PCR米用Taqman探针突光定量技术,综合生物学、酶学和突光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了 PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，与定性PCR技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。能够满足AMLl-ETO融合基因mRNA微量残留的检测，被认为是目前首选检测方法，用于评价治疗效果、预测预后。实时荧光定量PCR中常见的方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本发明采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于AMLl-ETO的基因检测。

【发明内容】

[0007]鉴于现有技术中检测AMLl-ETO融合基因的不足，本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，用荧光定量PCR技术检测白血病AMLl-ETO融合基因相对表达量。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，开发了一种用于检测白血病AMLl-ETO融合基因相对表达量的试剂盒。
[0008]用于检测AMLl-ETO融合基因相对表达量的试剂盒，包括红细胞裂解液、TRIzol,氯仿、无水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT KU、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，其特征在于:`
检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、检测目的基因用上下游引物AML1-ETO-F, AML1-ETO-R，探针 AML1-ETO-Probe，检测内参基因 Abl 用引物 abl_F，abl_R，探针 abl-Probe ;其中，
AML1-ETO-F: GTCTTCACAAACCCACCGCAAG
AML1-ETO-R: GTCAGCCTAGATTGCGTCTTCA
AMLl-ETO-Probe:FAM-TGAGAAGCACTCCACAATGCCAGACTCACC-TAMRA
abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
[0009]进一步地，检测用上下游引物和探针的比例优选为:AML1-ET0-F: AMLl-ETO-R:AMLl-ETO-Probe 的摩尔比为 2: 2:1。
[0010]参照用上下游引物和探针的比例优选为:于abl-F: abl-R: abl-Probe的摩尔比为2:2:1。
[0011]所述阳性对照品为含有AMLl-ETO基因的溶液；所述阴性对照品为无AMLl-ETO基因的溶液。[0012]其中的ReverTra Ace qPCR RT Kit为TOYOBO公司生产的qPCR用cDNA试剂盒产
品O
[0013]THUNDERBIRD qPCR MIX为TOYOBO公司生产的定量PCR试剂，产品规格为QPS-101。
[0014]使用本发明的试剂盒，将实时荧光PCR技术结合采用Tapman探针，可以对AML1-ET0)融合基因的表达水平进行检测，检测精度高，而且操作简单，可降低检测成本，节约检测时间。采用双标准曲线法，通过构建AMLl-ETO和内参基因abl的标准定量曲线，精确定量样本的内参基因拷贝数和AMLl-ETO拷贝数，相比于以往的免疫组化方法和现今的ΔΔ CT法，该试剂盒具有精度高，结果便于判读等优点。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使扩增效率和速率等实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。有助于临床上急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者体内AMLl-ETO融合基因的微量残留检测，对于及时干预治疗避免血液学复发、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。
【专利附图】

【附图说明】
[0015]图1:AML1-ET0型阳性结果示意图。
[0016]图2:AML1-ET0型阴性结果示意图。
【具体实施方式】
[0017]实施例1
本发明的用于检测AMLl-ETO融合基因相对表达量的试剂盒，包括:
红细胞裂解液；
TRIzol ；
氯仿；
无水乙醇；
ReverTra Ace qPCR RT Kit (Τ0Υ0Β0 公司)；
检测体系PCR反应液:THUNDERBIRD Probe qPCR Mix (2X )、检测目的基因用上下游引物 AML1-ETO-F,AMLl-ETO-R 各 0.8uM、AMLl-ET0_Probe (探针)0.4 uM ;检测内参基因 Abl用上下游引物 abl-F, abl-R 各 0.8uM、abl-probe (探针)0.4uM ;其中:
AML1-ETO-F: GTCTTCACAAACCCACCGCAAG
AML1-ETO-R: GTCAGCCTAGATTGCGTCTTCA
AMLl-ETO-Probe:FAM-TGAGAAGCACTCCACAATGCCAGACTCACC-TAMRA
abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
[0018]阳性对照品:含有AML1-ET0基因的溶液；
阴性对照品:不含AML1-ET0基因的溶液。
[0019]实施 例2
本发明试剂盒的使用方法:(I)抽提血液中的组织RNA:在洁净的1.5ml的离心管中加入Iml红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀。室温静置IOmin ；5000rpm离心5min,弃上清,收集底部的细胞；再次加入0.5ml红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入ImlTRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静止5min ;加入0.2ml氯仿，震荡均匀；HOOOrpm40C离心lOmin，吸取上清层转移至另一新的离心管中；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置IOmin ；14000rpm 4°C离心IOmin,弃上清,加入75%乙醇Iml,轻轻上下颠倒洗漆管壁；14000rpm 4°C离心5min,弃乙醇；室温干燥10_15min,加入20ulRNase_free水溶解沉淀。
[0020](2)参考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将RNA反转为 cDNA。
[0021](3)试剂配置:按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X ul，每人份23ul分装: X=23ul反应液X (8份内参(标准曲线)+8份目的基因(标准曲线)+η份标本+1份阳
性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；
(4)加样:加入检测体系PCR反应液中2ulcDNA ;阳性对照和阴性对照直接加2ul阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2ul生理盐水或不加任何物质。
[0022](5)检测:检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500 (美国Applied Biosystems 公司)等。反应条件:95°C预变性 Imin ;95°C 15s, 58°C 35sec 40 个循环，突光信号于58°C 35 sec时米集。
[0023](6)结果判断:将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和CT值自动计算出拷贝数。
`[0024]I)内参阳性时，检测结果才认为有效；
2)阳性判断标准:，Ct〈36，为阳性；35 ^ Ct ^ 38，为疑似阳性，需要再次验证；Ct >38，为阴性。
[0025]实施例3
采用本发明核酸检测试剂盒检测临床标本
取送检的急性早幼粒细胞白血病(APL)患者抗凝血标本共80例，按实施例2所述方法提取基因组RNA、配制试剂并检测。
[0026]每份标本加入检测体系PCR反应液中2ul。同时做阳性，阴性，空白对照，内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测38份样品，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。检测时间仅为100分钟。
[0027]实验结果与特检实验室的报告结果相比较，确定样品检测的准确率。部分阳性结果如下表:
【权利要求】
1.检测AMLl-ETO融合基因相对表达量的引物，其特征在于:所述引物包括(I)检测目的基因用上下游引物AML1-ET0-F，AML1-ET0-R,探针AML1-ETO-Probe，和(2)检测内参基因 Abl 用引物 abl-F，abl_R，探针 abl-Probe ;其中，
AML1-ETO-F: GTCTTCACAAACCCACCGCAAG
AML1-ETO-R: GTCAGCCTAGATTGCGTCTTCA
AMLl-ETO-Probe:FAM-TGAGAAGCACTCCACAATGCCAGACTCACC-TAMRA
abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于AMLl-ETO-F: AMLl-ETO-R:AMLl-ETO-Probe 的摩尔比为 2: 2:1。
3.如权利要求1所述的引物，其特征在于abl-F: abl-R: abl-Probe的摩尔比为2:2: 10
4.如权利要求1所述的引物，其特征在于所述阳性对照品为含有AMLl-ETO基因的溶液；所述阴性对照品为无 AMLl-ETO基因的溶液。
5.检测AMLl-ETO融合基因相对表达量的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)抽提血液中的组织RNA； (2)将RNA反转为cDNA； (3)试剂配置:检测体系PCR反应液:THUNDERBIRDProbe qPCR Mix (2X)、检测目的基因用上下游引物 AML1-ET0-F，AMLl-ETO-R 各 0.8uM、AML1-ΕΤΟ-Probe (探针)0.4 uM ;检测内参基因Abl用上下游引物abl-F，abl-R各0.8uM、abl-probe (探针)0.4uM ;其中:
AML1-ETO-F: GTCTTCACAAACCCACCGCAAG
AML1-ETO-R: GTCAGCCTAGATTGCGTCTTCA
AMLl-ETO-Probe:FAM-TGAGAAGCACTCCACAATGCCAGACTCACC-TAMRA
abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA ； 阳性对照品:含有AML1-ET0基因的溶液； 阴性对照品:不含AML1-ET0基因的溶液； (4)加样:加入检测体系PCR反应液中2ulcDNA;阳性对照和阴性对照直接加2ul阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2ul生理盐水或不加任何物质； (5)检测:检测在实时荧光PCR仪上进行，反应条件:95°C预变性Imin；95°C 15s，58°C35sec 40个循环，荧光信号于58°C 35 sec时采集； (6)结果判断。
【文档编号】C12N15/11GK103805698SQ201410031099
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年5月30日 优先权日:2012年5月30日
【发明者】周晓犊, 王淑一, 徐建成 申请人:北京艾迪康医学检验所有限公司