Alk基因和eml4基因检测探针及其制备方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术，特别是设及ALK基因和EML4基因检测探针及其制备方法和 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 2014年，肿瘤登记年报提示肺癌在全国恶性肿瘤的发病率(35.23/10万，19.59% ) 和死亡率(27.93/10万，24.87%)中居第一位。肺癌的发生被认为是一个多步骤过程，与原 癌基因的扩增/激活和/或肿瘤抑癌基因的失活密切相关，随着越来越多癌症驱动因子的发 现，为患者提供了祀向治疗的机会。研究发现，64%的肺腺癌患者检测出癌症驱动因子，其 中，8%为ALK重排。ALK基因融合不是晚期NS化C的有利预后因素，但crizotin化可改善ALK 阳性患者的生存。既往研究显示，EML4-ALK基因融合变异率为2 %~7 %。2011年美国临床肿 瘤学会(ASC0)年会报道的一项研究显示，经EML4-ALK抑制剂crizotinib治疗的ALK阳性者 的1年、2年生存率分别为74%和54%，且接受crizotin化二、Ξ线治疗ALK阳性者的生存率 显著高于ALK阳性对照组和AL啡月性对照组。肺癌中ALK变异主要为ALK基因发生重排与其他 基因融合。EML4-ALK(棘皮动物微管结合蛋白样4-间变性淋己瘤激酶)融合基因变异是其主 要类型，约占所有NS化C的5 %左右。肺癌中与ALK基因融合的其他基因还包括TFG、KIF5B等。 EML4-ALK融合基因可见于多种肿瘤，例如间变性大细胞淋己瘤、炎性成肌纤维细胞瘤、成神 经细胞瘤和NS化C等，它是由第2号染色体短臂插入引起。ALK融合基因通过下游底物分子的 激活、传递，各转导途径的相互交叉、重合，形成了一个错综复杂的信号转导网络，影响细胞 增殖、分化和调亡。EML4-ALK融合基因通过融合伴侣的胞外螺旋结构域，使两个EML4-ALK 分子的激酶区相互结合，形成稳定的二聚体，通过自身憐酸化活化下游MAPK、PI3K/AKT、 JAK/STAT3等通路，从而引起细胞向恶性转化。
[0003] ALK基因重排最早在间变性淋己瘤中被发现和命名，2007年在肺癌中发现，作为酪 氨酸激酶信号通路的一员，ALK基因异常可能在更多的癌种中被发现，并且其祀向药物的适 应症也将不断扩展。
[0004] 因此，研究用于该基因的检测试剂盒，并用于临床样本检测，对于筛选祀向药物受 益人群极有益处。
[000引杂交所用的探针大致可W分类Ξ类：1)染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫 星III类的探针，其杂交祀位常大于1Mb，不含散在重复序列，与祀位结合紧密，杂交信号强， 易于检测；2)全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上 极端不同的核巧酸片段所组成，可由克隆到隧菌体和质粒中的染色体特异大片段获得;3) 特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
[0006]探针的巧光素标记可W采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记 DNA探针，杂交之后用截联有巧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可W利用亲和 素-生物素-巧光素复合物，将巧光信号进行放大，从而可W检测500bp左右的片段。而直接 标记法是将巧光素直接与探针核巧酸或憐酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针 时将巧光素核巧Ξ憐酸渗入。直接标记法在检测时步骤简单，临床使用方便。
[0007] 而目前对于ALK/EML4基因 FISH检测，还缺少特异性高的检测试剂盒。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的之一是提供一种ALK基因检测探针及其制备方法，所制备的探针可 用于检测ALK基因重排鉴定，具有很好的特异性。
[0009] 实现上述目的的技术方案如下。
[0010] 一种ALK基因检测探针的制备方法，包括W下步骤：
[0011] (1)选取针对 ALK 基因的 BAC 克隆为 RP11-62B19、RP11-100C1和 CTD-2245E6 中至少 一种作为一组探针，和选取BAC克隆为CTD-2544111、RP11-68403和RP11-134013中的至少一 种作为另一组探针；
[0012] (2)对克隆分别提取质粒，得到质粒DNA，定量；
[0013] (3)用巧光素标记质粒DNA，同组探针的巧光素的颜色相同，不同组探针的巧光素 的颜色不相同，即来源于BAC克隆为RP11-62B19、RP11-100C1和CTD-2245E6的探针与来源于 BAC克隆为CTD-2544I1URP11-68403和RP11-134013的探针的巧光素的颜色不相同，即得。
[0014] 本发明的另一是提供一种ALK基因和EML4基因检测探针及其制备方法，所制备的 探针可用于检测ALK基因和EML4基因状态，即用于EML4/ALK基因融合鉴定，具有很好的特异 性。
[001引一种ALK基因和EML4基因检测探针的制备方法，包括W下步骤：
[0016] (1)选取针对 ALK 基因的 BAC 克隆为 1?口11-62819、1?口11-100(：1和圳0-224566中至少 一种作为一组探针，和选取BAC克隆为CTD-2544111、RP11-68403和RP11-134013中的至少一 种作为另一组探针；W及选取针对EML4基因的BAC克隆为CTD-2358L8和CTD-2547J15中至少 一种；
[0017 ] (2)对克隆分别提取质粒，得到质粒DNA，定量；
[0018] (3)用巧光素标记质粒DNA，针对ALK基因和针对EML4基因的检测探针标记的巧光 素的颜色不相同，且针对ALK基因中，同组探针的巧光素的颜色相同，不同组探针的巧光素 的颜色不相同，即来源于BAC克隆为RP11-62B19、RP11-100C1和CTD-2245E6的探针与来源于 BAC克隆为CTD-2544I1URP11-68403和RP11-134013的探针的巧光素的颜色不相同，即得。
[0019] 在其中一个实施例中，所述ALK重排探针包括两组，分别为第一组BAC克隆为RP11- 62B19、RP11-100C1和 CTD-2245E6;第二组 BAC 克隆为 CTD-2544111、RP11-68403 和 RP11- 1：34013。
[0020] 在其中一个实施例中，所述EML4探针包括一组，第Ξ组BAC克隆为CTD-2358L8和 CTD-2547J15。
[0021] 在其中一个实施例中，标记巧光素选择本领域已知的巧光染料，优选地，巧光素为 Alexa Fluor驳 i88、FITC、Alexa Fluor驳.555、Rhodamine 'Texas Red、pacif ic blued)、 DEACo
[0022] 在其中一个实施例中，基因探针的标记可W采用现有技术中的方法将相应巧光素 标记至双链核酸上，所述方法包括但不限于：随机引物法、切口平移等，标记基因探针可W 使用市售的缺口平移标记试剂盒和随机引物标记试剂盒，优选abbott和Roche公司的Nick Translation Kit。本发明步骤(3)优选采用随机引物法、切口平移法对质粒DM进行巧光素 标记。
[0023] 在其中一个实施例中，所述标记的溫度为15°C-18°C，标记的时间为8-12小时。
[0024] 本发明的另一目的是提供一种ALK基因和EML4基因检测试剂盒。
[0025] 实现该目的技术方案如下。
[0026] 一种ALK基因和EML4基因检测试剂盒，包括有上述ALK基因和EML4基因检测探针。
[0027] 在其中一个实施例中，还包括有用于封闭重复序列的COT Human DNA，和DAPI复染 剂。
[0028] 本发明具有W下有益效果：
[0029] (1)本发明通过筛选到最优的EML4/ALK基因重排检测探针及其组合，既可W检测 未知的与ALK相关重排，也可W直接鉴别EML4/ALK重排。
[0030] (2)采用本发明所述的方法对ALK基因重排进行检测，信号计数行准确、快速，且结 果的重复性好;补充了临床中检测试剂依赖进口的不足，有利于后续该检测探针应用于临 床研究，进行肺癌分子分型，祀向治疗等方面。
【附图说明】
[0031 ]图1A为是实施例1中ALK基因检测探针序列的示意图。
[0032] 图1B为是实施例1中EML4基因检测换针序列的不意图。
[0033] 图2A为实施例1中人外周血培养细胞片ALK基因检测探针FISH检测结果图。
[0034] 图2B为实施例1中人外周血培养细胞片ALK基因和EML4基因检测探针FI細检测结 果图。
[0035] 图3A为实施例4中肺癌组织样本ALK基因 FI甜检测结果图，其中，检测信号类型为 2F(RG相邻或重合），ALK基因未重排。
[0036] 图3B为实施例4中肺癌组织样本ALK基因和EML4基因 FI細检测结果图，其中，检测 信号类型为2F2A，ALK基因未重排，未发生EML4/ALK重排。
[0037] 图4A为实施例4中肺癌组织样本ALK基因 FI甜检测结果图，其中，检测信号类型为 1F1G1R，对比正常信号类型2F，发生了 F信号断裂，检测结果为:ALK基因重排。
[003引图4B为实施例4中肺癌组织样本ALK基因和EML4基因 FI甜检测结果图，，其中，检测 信号类型为1F1A1G1RA，对比正常信号类型2F2A，发生了 F信号断裂，并同时发生RA信号融 合，检测结果为:ALK基因断裂，重排类型为EML4/ALK。
【具体实施方式】
[0039] 为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可许多不 同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供运些实施例的目的是使对本 发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0040] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring 化rbor Laboratory Press, 1989)中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售 产品。
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