一种检测融合基因AML1-ETO mRNA表达的试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明提出了一种检测融合基因AML1-ETO?mRNA表达的试剂盒，采用TaqMan荧光探针技术，选取融合基因AML1-ETO及内参基因ABL为靶区域，分别设计特异性引物及荧光探针，其中荧光探针5’端标记荧光发射基团FAM，3’端标记非荧光淬灭基团BHQ1，利用荧光PCR检测仪可在FAM通道检测荧光信号，由于内参基因ABL在细胞中的表达相对恒定，在本试剂盒中可作为内参对起始细胞量进行校正，用于整个核酸提取和反应体系的质量控制。本发明还提出了上述检测融合基因AML1-ETO?mRNA表达的试剂盒的检测方法。本发明具有很高的灵敏度和特异性，有利于诊断、评价患者疗效、预后及对微小残留病变复发的监测。
【专利说明】-种检测融合基因 AML1-ET0 mRNA表达的试剂盒及其检测 方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测融合基因 AML1-ET0 mRNA表达的试剂盒，特别是涉及以一步 法Real-Time qPCR技术实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应技术快速、定量检测融合基因 AML1-ET0 mRNA的试剂盒，本发明还提出了上述检测融合基因 AML1-ET0 mRNA表达的试剂盒 的检测方法。
【背景技术】
[0002] AML1-ET0基因融合是由t(8 ;21) (q22 ;q22)染色体易位而形成的，其编码的蛋白 产物为一种多功能蛋白质，可通过影响细胞内许多信号传导系统和靶分子而参与细胞的分 化与增值、细胞凋亡以及自我更新等过程，在t(8 ;21) (q22 ;q22)染色体易位阳性的急性 髓系白血病（AML)特别是AML-M2型白血病的发生发展中起着非常重要的作用。（t(8;21) (922;922)易位）占41^的20%-40%，特别是在儿童？48-]?2中多见。以8 ;21)(922;922) 易位引起AML1 基因 （acute myeloblastic leukemia one gene)和ΕΤ0基因 （eight twenty one gene，也称为MTG8基因）的融合。AML1基因断裂点在第5、6外显子之间，ETO断裂点在 第2外显子的上游，AML1第5外显子和ΕΤ0第2外显子融合形成AML1/ET0基因，目前尚未 发现AML1/ET0其他断裂点引起的转录本。t(8 ;21) (q22 ;q22)阳性是预后好的标志，其完全 缓解（CR)率可达90 %，5年长期无病生存率（event-free survival, EFS)可达50 % -70 %。 目前常用的实验室检测方法主要包括染色体核型分析、FISH、PCR检测等。
[0003] Real-TimePCR技术是今年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核 电偶联装置（CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映 PCR的每个循 环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧 光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。一步法Real-Time RT-PCR技术 是 Real-Time PCR 的一种（Yuqi Z，Min Y，Johann WM，et al. 2002. Quantification of human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral DNA by Using TaqMan Technology. J Cli Microbiol. 40(2) :675-678 ；Drosten C, Seifried E, Roth WK, et al. 2001. TaqMan 5-nuclease human immunodeficiency virus type 1 PCR assay with phage-packaged competitive internal control for high-throughput blood donor screening. J Clin Microbiol,39:4302-4308 ；Schuurman R, Descamps D,Weverling GJ, et al. Multicenter comparison of three commercial methods for quantification of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J Clin Microbiol. 1996 Dec ； 34(12):3016-22 ；Christopherson C,Kidane Y, Conway B, et al. PCR-Based assay to quantify human immunodeficiency virus type 1 DNA in peripheral blood mononuclear cells. J Clin Microbiol. 2000 Feb ;38(2) :630-4.)，它是一种直接快速检测 RNA 的方法， 与检测DNA的Real-Time PCR相比，不同之处在于前者在反应体系中增加了逆转录酶，同时 多了一个逆转录反应步骤；相同之处在于两者在反应体系中均有一条两端分别标记荧光报 告基团和淬灭基团的探针，探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基 团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切 断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基 团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的在于提出一种检测融合基因 AML1-ET0 mRNA表达的试剂盒， 本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对外周血或骨髓样本中融 合基因 AML1-ET0 mRNA进行定量检测，检测急性髓系白血病（AML)等血液系统肿瘤中融合 基因 AML1-ET0 mRNA的表达水平，以有利于评价患者化疗效果、预后及对微小残留病变复发 的监测。
[0005] 本发明的第二个目的在于提出上述检测融合基因 AML1-ET0 mRNA表达的试剂盒的 检测方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明的第一个目的通过以下技术方案予以实现：
[0007] 一种检测融合基因 AML1-ET0 mRNA表达的试剂盒，包括：（a) RNA提取试剂、 AML1-ET0反应液、ABL反应液、一步法PCR酶系、AML1-ET0阳性定量参考品1-5、ABL阳性定 量参考品1-4和DEPC水；(b)分隔并集中包装上述试剂的试剂管的包装盒；
[0008] 所述的RNA提取试剂包括5 X的红细胞裂解液、RNA提取液-Trizol试剂、氯仿、 异丙醇和DEPC乙醇；
[0009] 所述的AML1-ET0反应液包括正向引物、反向引物、AML1-ET0的寡核苷酸探针、PCR 反应缓冲液，其中AML1-ET0反应液中正向和反向引物分别是：
[0010] 5, -GGATGGGCCCCGAGAAC-3，（SEQ ID N0:1);
[0011] 5' -GTCAGCCTAGATTGCGTCTTCA-3'（SEQ ID N0:2);
[0012] AML1-ET0 的寡核苷酸探针是：5'-X-TCGAAATCGTACTGAGAAGCACTCCA-Y-3'（SEQ ID NO:3)，其中X表示的是荧光报告基团，Y表示的是荧光淬灭基团；
[0013] 所述的ABL反应液包括正向引物、反向引物、ABL的寡核苷酸探针、PCR反应缓冲 液，其中ABL反应液中正向和反向引物分别是：
[0014] 5'-GACGTCTGGGCATTTGGAGTA-3'（SEQ ID N0:4)
[0015] 5'-TCATACACCTGGGACAGGTCAA-3'（SEQ ID N0:5)
[0016] ABL 的寡核苷酸探针是：5'-X-ATGGCATGTCCCCTTACCCGGGA-Y-3'（SEQ ID N0:6)， 其中X表不的是突光报告基团，Y表不的是突光淬灭基团；
[0017] 所述的AML1-ET0阳性定量参考品1-5为均含有浓度为1 X 103拷贝/5 μ L?1 X 107 拷贝/5 μ L的AML1-ET0目的片段的重组质粒；所述的ABL阳性定量参考品1-4为均含有浓 度为1 X 103拷贝/5 μ L?1 X 106拷贝/5 μ L的ABL目的片段的重组质粒。
[0018] 本发明是使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物和探针，用分子筛和快速蛋 白质液相层析法（FPLC)纯化后进行氨解处理；同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别 在其5'端标记作为荧光发生基团（报告基团）的6-FAM amidite，并在其3'端标记借助活 性连接臂偶联上作为荧光淬灭或抑制基团的BHQ1，以FPLC层析法纯化荧光标记的探针，然 后，使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶（20%)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引 物和探针。
[0019] 本试剂盒采用TaqMan荧光探针技术，选取融合基因 AML1-ET0及内参基因 ABL为 靶区域，分别设计特异性引物及荧光探针，其中荧光探针5'端标记荧光发射基团FAM，3'端 标记非荧光淬灭基团BHQ1，利用荧光PCR检测仪可在FAM通道检测荧光信号。由于内参基因 ABL在细胞中的表达相对恒定，在本试剂盒中可作为内参对起始细胞量进行校正，用于整个 核酸提取和反应体系的质量控制。通过简单易操作的核酸提取系统，结合Real-Time PCR 检测系统运行一步法RT-PCR扩增程序，本试剂盒实现了检测的高特异、高灵敏和高效率。
[0020] 进一步地，所述的AML1-ET0反应液和ABL反应液中的PCR缓冲液包含10mmol/L 的 Tris-HCl 缓冲液、50mmol/L 的 KC1 溶液和 3. Ommol/L 的 MgCl2 溶液。
[0021] 进一步地，所述一步法PCR酶系包括逆转录酶、热启动Taq酶、RNA酶抑制剂、dNTPs 以及酶稀释液，其中逆转录酶的用量为1. 5?3. 5U/人份、热启动Taq酶的用量为3?7U/ 人份、RNA酶抑制剂的用量为15?25U/人份、dNTPs浓度为0. 20mmol/L、酶稀释液为一般 市售的酶稀释液。
[0022] 进一步地，应用于靶多核苷酸扩增的所述的AML1-ET0反应液中引物和探针所用 的浓度均为2?lOpmol/人份，优选引物浓度为5pmol/人份、探针浓度为3pmol/人份。
[0023] 进一步地，所述的ABL反应液中引物和探针所用的浓度均为2?lOpmol/人份，优 选引物浓度为5pmol/人份、探针浓度为3pmol/人份。
[0024] 进一步地，所述试剂盒的待检样本是外周血或骨髓。
[0025] 本发明提供的一步法Real-Time qPCR试剂盒可以检测出融合基因 AML1-ET0的灵 敏度为250拷贝/5uL，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。
[0026] 本发明针对融合基因 AML1-ET0基因设计特异性引物和探针，检测的线性范围为 5X 108 拷贝 /5uL ?5X 102 拷贝 /5uL。
[0027] 本发明的第二个目的通过以下技术方案予以实现：
[0028] -种检测融合基因 AML1-ET0 mRNA表达的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
[0029] (1)标本采集
[0030] 标本采集：抽取受检者静脉血或骨髓3?5ml，注入含乙二胺四乙酸二钠或枸橼酸 钠抗凝剂的采血管，立即轻缓颠倒采血管混合5?10次，使抗凝剂与静脉血或骨髓充分混 匀，密闭待用；
[0031] ⑵核酸提取
[0032] (a)先将5X的红细胞裂解液用无菌纯化水稀释得到IX的红细胞裂解液；(b) 取5mL洁净离心管加入抗凝血2mL ; (c)向离心管中加入2mL 1 X的红细胞裂解液，盖紧管 盖，漩润振荡15s以充分混勻，室温放置3min ; (d)室温下6000rpm离心5min，去上清，保留 沉淀；(e)重复步骤（c)和（d)，尽可能吸除残存液体；（f)向离心管中加入lmL RNA提取 液-Trizol试剂，盖紧管盖，漩涡振荡15s以充分混匀，再将其转移至1. 5mL离心管并静置 5min ; (g)继续向离心管中加入200 μ L氯仿，盖紧管盖，用力上下振摇15s，15?30°C静置 3min，4°C条件下12000rpm离心15min，离心后得到酚-氯仿下层、中间层及无色水相上层； (h)小心吸取400 μ L上层水相转移到另一洁净离心管中，加入500 μ L异丙醇，盖紧管盖， 上下颠倒3次，15-30°C条件下静置10min，然后4°C条件下12000rpm离心10min离心后可 见白色胶状RNA沉淀，去上清；（i)加入向离心管中加入lmL 75%的DEPC乙醇洗涤RNA沉 淀，混匀，4°C条件下12000rpm离心5min，小心吸去大部分DEPC乙醇，短暂离心，再吸去剩余 DEPC乙醇，打开离心管盖将沉淀在室温空气中干燥5min以使痕量乙醇挥发；（j)用50 μ L DEPC水溶解沉淀，室温静置2min，RNA溶液可立即进行PCR或存于-70± 10°C备用；
[0033] (3) PCR 检测
[0034] (a)配置体系
[0035] AML1-ET0反应体系：将3 μ L反应酶系和17 μ L AML1-ET0反应液充分混合，然后 分装20 μ L至若干PCR反应管；
[0036] ABL反应体系：将3 μ L反应酶系和17 μ L ABL反应液充分混合，然后分装20 μ L至 若干PCR反应管；
[0037] (b)加样、扩增
[0038] 往上述装有AML1-ET0反应体系的不同的反应管中分别加入提取后的待测核酸 5 μ L、阴性对照品-DEPC水5 μ L和AML1-ET0阳性定量参考品5 μ L，往上述装有ABL反应体 系的不同的反应管中分别加入提取后的待测核酸5 μ L、阴性对照品-DEPC水5 μ L和ABL阳 性定量参考品5 μ L，各自盖紧反应管盖，SOOOrpm离心数秒后转移至PCR扩增仪进行扩增， 扩增完成后收集荧光信号，并保存检测数据文件；
[0039] 扩增时ABI7300/7500荧光PCR扩增仪参数设置如下：
[0040] Reporter Dyel ：FAM
[0041] Quencher Dye ：none
[0042] Passive Reference ：none
[0043] LightCycler480荧光PCR扩增仪的参数设置如下：
[0044] "Customizes"模块中选择 FAM(483-533)滤片；
[0045] 扩增的温度参数统一设置如下：扩增的反应温度和时间为：50°C 15min，1个循环； 95°C 15min，1 个循环；之后 94°C 15s，55°C 45s，40 ?50 个循环；
[0046] (c)结果分析
[0047] 按对应顺序设置AML1-ET0的5个阳性定量参考品，Task中设为Standard， Quantity中设为对应的拷贝数，然后根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以 及Threshold值（用户可根据实际情况自行调整，start值可以在1?10、stop值可以在 5?20、Threshold值可以在5K?50K范围选择），使"Standard curve"窗口下的标准曲 线图达到最佳，即R2值（correlation数值）彡0· 97,最后到"Report"窗口下记录仪器自 动分析计算出的AML1-ET0未知标本的拷贝数（AML1-ET0-Qty)，将该结果导出，然后重新按 对应顺序设置ABL的4个阳性定量参考品，步骤同前，将ABL未知标本的拷贝数（ABL-Qty) 导出；
[0048] ⑷结果判定
[0049] 如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值为空白，则判所检测的基因表达量小于检测限 度；
[0050] 如果增长曲线呈S型曲线且ABL的Ct值< 35,则样品的AML1-ET0/ABL表达量为 AML1-ΕΤΟ-Qty/ABL-Qty 〇
[0051] 进一步地，所述的AML1-ET0阳性定量参考品1-5为均含有浓度为1X103拷贝 /5 μ L?1 X 107拷贝/5 μ L的AML1-ET0目的片段的重组质粒；所述的ABL阳性定量参考品 1-4为均含有浓度为1 X 103拷贝/5 μ L?1 X 106拷贝/5 μ L的ABL目的片段的重组质粒。
[0052] 进一步地，所述标本在2?8 °C条件下保存不应超过48小时；或者保存 在-20±5°C待测，保存期为1个月；或者使用红细胞裂解液处理全血或骨髓，获得有核细胞 沉淀后加入lml RNA提取液，振荡混匀，于-70±10°C保存1个月；避免反复冻融；标本的运 输条件为〇°C左右。
[0053] 进一步地，扩增的反应温度和时间为：50°C 15min-个循环，95°C 15min-个循环； 94°C 15s，55°C 45s 40个循环，荧光检测选择在55°C 45s这一环节。
[0054] 特别值得说明的是，为了确保本发明的基因 mRNA检测方法的准确性，另外使用携 带有AML1-ET0基因（cDNA)序列的重组质粒作为DNA阳性定量参考品。借助这些额外标准 品，使用本发明的试剂盒在相同条件下进行平行检测并制作所谓的外标定量标准曲线，以 进一步验证本发明试剂盒的检测精密度和准确性，并作为生产本发明试剂盒附加的质量控 制标准。
[0055] 与基于扩增反应完成后进行单一终点检测的传统PCR试剂盒不同，Real-Time qPCR试剂盒可以在扩增反应的进程中随时监测扩增产物的产生，从而大大提高了定量检测 的准确性和精密度。众所周知，Real-Time qPCR是在PCR扩增体系中，同时加入引物和5'、 3'末端分别标记有荧光报告基团（例如6-FAM amidite羧基荧光素6)和荧光淬灭基团 (例如6-羧基四甲基若丹明）的特异性寡核苷酸探针。如果探针没有与靶序列互补结合， 其序列保持完整，报告基团发射的荧光信号将被淬灭基团吸收，所以没有荧光信号产生；而 当PCR扩增反应进行时，DNA聚合酶的5' -3'外切酶活性将降解荧光探针，导致荧光报告基 团与荧光淬灭基团分离，因而荧光监测系统可接收并记录到荧光信号。每扩增一条DNA链 即有一个荧光分子产生，从而实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，实时地监测 整个PCR反应进程，并可借助标准曲线对未知靶多核苷酸（模板）进行定量分析。
[0056] 利用已知起始拷贝数的标准品制作标准曲线，其中以靶多核苷酸起始拷贝数的对 数为横坐标，并以如上测得的Ct值为纵坐标。获得未知量靶多核苷酸的Ct值后，即可从 基于平行实验得到的数据制作的标准曲线上得知其起始拷贝数的对数，然后计算出该靶多 核苷酸的起始拷贝数（当扩增循环达到Ct值即初始进入指数扩增期时，Ct值得重现性极 好，即同一靶多核苷酸在不同时间扩增或同一时间在不同管内扩增所得到的Ct值总是恒 定的）。也就是说，基于上述的扩增反应结果推算出靶多核苷酸的量（起始拷贝数）。具体 实现包括：（1)确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值 时所需的阈循环次数；（2)将已确定的样品中靶多核苷酸的阈循环次数与标准溶液中已知 量靶多核苷酸的阈循环次数相比较，从而计算出样品中靶多核苷酸的量。
[0057] 与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
[0058] 1)本发明使用适当的核酸分析软件分别对已知的融合基因 AML1-ET0基因的核苷 酸序列进行同源性比较，在找到同源区段的基础上，进一步使用适当的引物设计软件选择 并设计寡核苷酸引物和探针，由于所设计的引物和探针均具有互补于AML1-ET0基因的序 列，而且与其他病原体的核苷酸序列没有同源性，也不包括任何常见的核酸内切酶的酶切 位点，所以避免了融合基因 AML1-ET0检测的假阴性和假阳性，提高了检测的可靠性和准确 度，同时设置了内参ABL基因作为相对定量标准，用于整个反应体系的质量控制，在本试剂 盒中可作为内参对起始细胞量进行校正；
[0059] 2)适宜于一步法Real-Time qPCR扩增的逆转录酶、热启动Taq酶、2' -脱氧核苷 三磷酸、RNA酶抑制剂（RNasin)、能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向引物、能 够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物、能够与靶多聚核苷酸结合并且两末端 分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、能够与内标核苷酸结合并且两 末端分别结合有荧光发生基团和淬灭基团的检测内标的寡核苷酸探针、含有镁离子的缓冲 液；
[0060] 3)通过检测急性髓系白血病（AML)等血液系统肿瘤中融合基因 AML1-ET0的mRNA 表达水平，有利于评价患者化疗效果、预后及对微小残留病变复发的监测；
[0061] 4)全封闭反应，提取RNA以后，直接用于Real-Time qPCR检测，避免了污染发生；
[0062] 5)由于内参基因 ABL在细胞中的表达相对恒定，因此，本试剂盒中选择ABL作为内 参对起始细胞量进行校正，用于整个核酸提取和反应体系的质量控制；
[0063] 6)同时使用携带有AML1-ET0基因和内参ABL基因序列的重组质粒作为阳性定量 参考品，使用本发明的试剂盒在相同条件下进行相对定量的平行检测，从而可确保检测结 果的可靠性。
【专利附图】
【附图说明】
[0064] 图1为AML1-ET0阳性定量参考品1-5、阴性质控品的检测结果；
[0065] 图2为ABL阳性定量参考品1-4、阴性质控品的检测结果；
[0066] 图3为AML1-ET0基因的特异性实验结果；
[0067] 图4为8份白血病患者的样本的检测结果。
【具体实施方式】
[0068] 为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明 作进一步的说明。
[0069] 实施例1
[0070] 一种Real-Time qPCR检测融合基因 AML1-ET0 mRNA表达的试剂盒，包括：（a) RNA 提取试剂、AML1-ET0反应液、ABL反应液、一步法PCR酶系、AML1-ET0阳性定量参考品1-5、 ABL阳性定量参考品1-4和DEPC水；(b)分隔并集中包装上述试剂的试剂管的包装盒；
[0071] 所述的RNA提取试剂包括5X的红细胞裂解液、RNA提取液-Trizol试剂、氯仿、 异丙醇和DEPC乙醇；
[0072] 所述的AML1-ET0反应液包括正向引物、反向引物、AML1-ET0的寡核苷酸探针、PCR 反应缓冲液，其中AML1-ET0反应液中正向和反向引物分别是：
[0073] 5, -GGATGGGCCCCGAGAAC-3，（SEQ ID N0:1);
[0074] 5' -GTCAGCCTAGATTGCGTCTTCA-3'（SEQ ID N0:2);
[0075] AML1-ET0 的寡核苷酸探针是：5'-X-TCGAAATCGTACTGAGAAGCACTCCA-Y-3'（SEQ ID NO:3)，其中X表示的是荧光报告基团，Y表示的是荧光淬灭基团；
[0076] 所述的ABL反应液包括正向引物、反向引物、ABL的寡核苷酸探针、PCR反应缓冲 液，其中ABL反应液中正向和反向引物分别是：
[0077] 5'-GACGTCTGGGCATTTGGAGTA-3'（SEQ ID N0:4)
[0078] 5,-TCATACACCTGGGACAGGTCAA-3，（SEQ ID N0:5)
[0079] ABL 的寡核苷酸探针是：5'-X-ATGGCATGTCCCCTTACCCGGGA-Y-3'（SEQ ID N0:6)， 其中X表不的是突光报告基团，Y表不的是突光淬灭基团；
[0080] 所述的AML1-ET0阳性定量参考品1-5为均含有浓度为1 X 103拷贝/5 μ L?1 X 107 拷贝/5 μ L的AML1-ET0目的片段的重组质粒；所述的ABL阳性定量参考品1-4为均含有浓 度为1 X 103拷贝/5 μ L?1 X 106拷贝/5 μ L的ABL目的片段的重组质粒。
[0081] 所述的AML1-ET0反应液和ABL反应液中的PCR缓冲液包含10mmol/L的Tris-HCl 缓冲液、50mmol/L的KC1溶液和3. Ommol/L的MgCl2溶液。
[0082] 一步法PCR酶系包括逆转录酶、热启动Taq酶、RNA酶抑制剂、dNTPs以及酶稀释 液，逆转录酶的用量为1. 5?3. 5U/人份、热启动Taq酶的用量为3?7U/人份、RNA酶抑制 剂的用量为15?25U/人份、dNTPs浓度为0. 20mmol/L、酶稀释液为一般市售的酶稀释液。
[0083] 所述的AML1-ET0反应液中引物和探针所用的浓度均为2?lOpmol/人份，优选引 物浓度为5pmol/人份、探针浓度为3pmol/人份。
[0084] 所述的ABL反应液中引物和探针所用的浓度均为2?lOpmol/人份，优选引物浓 度为5pmol/人份、探针浓度为3pmol/人份；所述试剂盒的待检样本是外周血或骨髓。
[0085] 实施例2
[0086] 一种检测融合基因 AML1-ET0 mRNA表达的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
[0087] (1)标本采集
[0088] 标本采集：抽取受检者静脉血或骨髓3?5ml，注入含乙二胺四乙酸二钠或枸橼酸 钠抗凝剂的采血管，立即轻缓颠倒采血管混合5?10次，使抗凝剂与静脉血或骨髓充分混 匀，密闭待用；标本立即用于测试，如不能立即进行测试，标本在2?8°C条件下保存不应超 过48小时；或者保存在-20±5°C待测，保存期为1个月；或者使用红细胞裂解液处理全血 或骨髓，获得有核细胞沉淀后加入lml RNA提取液，振荡混匀，于-70±10°C保存1个月；避 免反复冻融；标本的运输条件为〇°C左右；
[0089] (2)核酸提取
[0090] (a)将5 X浓度的红细胞裂解液稀释得到1 X的红细胞裂解液待用；(b)取5mL洁 净离心管加入抗凝血2mL;(c)向离心管中加入2mL IX的红细胞裂解液，盖紧管盖，漩涡振 荡15s以充分混勻，室温放置3min ; (d)室温下6000rpm离心5min，去上清，保留沉淀；（e) 重复步骤（c)和（d)，尽可能吸除残存液体；（f)向离心管中加入lmL RNA提取液，盖紧管 盖，漩涡振荡15s以充分混匀，再将其转移至1. 5mL离心管并静置5min ; (g)继续向离心管 中加入200 μ L氯仿，盖紧管盖，用力上下振摇15s (小心液体泄漏，有腐蚀性），15?30°C 静置3min，4°C条件下12000rpm离心15min，离心后得到酚-氯仿下层、中间层及无色水相 上层；(h)小心吸取400 μ L上层水相转移到另一洁净离心管中，加入500 μ L异丙醇，盖紧 管盖，上下颠倒3次，15-30°C条件下静置10min，然后4°C条件下12000rpm离心10min (注 意固定离心管方向），离心前通常看不见RNA沉淀，离心后可见白色胶状RNA沉淀，去上清； (i)加入向离心管中加入lmL 75%的DEPC乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，4°C条件下12000rpm 离心5min (注意固定离心管方向），小心吸去大部分DEPC乙醇，短暂离心，再吸去剩余DEPC 乙醇，打开离心管盖将沉淀在室温空气中干燥5min以使痕量乙醇挥发；（j)用50 μ L DEPC 水溶解沉淀，室温静置2min，RNA溶液可立即进行PCR或存于-70± 10°C备用；
[0091] (3)PCR 检测
[0092] (a)配置体系
[0093] AML1-ET0反应体系：将3 μ L反应酶系和17 μ L AML1-ET0反应液充分混合，然后 分装20 μ L至若干PCR反应管；
[0094] ABL反应体系：将3 μ L反应酶系和17 μ L ABL反应液充分混合，然后分装20 μ L至 若干PCR反应管；
[0095] (b)加样、扩增
[0096] 往上述装有AML1-ET0反应体系的不同的反应管中分别加入提取后的待测核酸 5 μ L、阴性对照品-DEPC水5 μ L和AML1-ET0阳性定量参考品5 μ L，往上述装有ABL反应体 系的不同的反应管中分别加入提取后的待测核酸5 μ L、阴性对照品-DEPC水5 μ L和ABL阳 性定量参考品5 μ L，各自盖紧反应管盖，SOOOrpm离心数秒后转移至PCR扩增仪进行扩增， 扩增完成后收集荧光信号，并保存检测数据文件；
[0097] 扩增时ABI7300/7500荧光PCR扩增仪参数设置如下：
[0098] Reporter Dyel ：FAM
[0099] Quencher Dye ：none
[0100] Passive Reference ：none
[0101] LightCycler480荧光PCR扩增仪的参数设置如下：
[0102] "Customizes"模块中选择 FAM(483-533)滤片；
[0103] 扩增的温度参数统一设置如下：扩增的反应温度和时间为：50°C 15min -个循环， 95°C 15min -个循环；94°C 15s，55°C 45s进行40个循环，荧光检测选择在55°C 45s这一环 节。
[0104] (C)结果分析
[0105] 按对应顺序设置AML1-ET0的5个阳性定量参考品，Task中设为Standard， Quantity中设为对应的拷贝数，然后根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以 及Threshold值（用户可根据实际情况自行调整，start值可以在1?10、stop值可以在 5?20、Threshold值可以在5K?50K范围选择），使"Standard curve"窗口下的标准曲 线图达到最佳，即R2值（correlation数值）彡0· 97,最后到"Report"窗口下记录仪器自 动分析计算出的AML1-ET0未知标本的拷贝数（AML1-ET0-Qty)，将该结果导出，然后重新按 对应顺序设置ABL的4个阳性定量参考品，步骤同前，将ABL未知标本的拷贝数（ABL-Qty) 导出；
[0106] (4)结果判定
[0107] 如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值为空白，则判所检测的基因表达量小于检测限 度；
[0108] 如果增长曲线呈S型曲线且ABL的Ct值< 35,则样品的AML1-ET0/ABL表达量为 AML1-ΕΤΟ-Qty/ABL-Qty 〇
[0109] 融合基因 AML1-ET0试剂盒中阳性定量参考品及阴性质控品包括AML1-ET0阳性定 量参考品1-5, ABL阳性定量参考品1-4和阴性质控品，用于质量控制。
[0110] 以下要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行：
[0111] 阴性质控品：AML1-ET0及ABL无荧光信号增长，无明显S型扩增曲线。
[0112] 阳性定量参考品：AML1-ET0及ABL有荧光信号增长，曲线呈S型曲线，Ct值< 37， 且 R2 >0. 97。
[0113] 未知标本的ABL的Ct值必须< 35。
[0114] 检测结果：
[0115] 如图1所示，AML1-ET0阳性定量参考品1-5有荧光信号增长，曲线成S型曲线，Ct 值< 37,且R2彡0. 97 ;可明确判定为阳性，阴性质控品的AML1-ET0无荧光信号增长，无明 显S型扩增曲线，可明确判定为阴性，检测结果均符合质量控制判断标准。
[0116] 如图2所示，ABL阳性定量参考品1-4有荧光信号增长，曲线成S型曲线，Ct值 < 37,且R2 > 0. 97 ;可明确判定为阳性，阴性质控品的ABL无荧光信号增长，无明显S型扩 增曲线，可明确判定为阴性，检测结果均符合质量控制判断标准。
[0117] 即从图1和图2可知：阴性质控品的AML1-ET0及ABL均无荧光信号增长； AML1-ET0阳性定量参考品1-5 FAM检测通路有荧光信号增长，曲线呈S型曲线，Ct值< 37， 且R2彡0. 97 ;ABL阳性定量参考品1-4 FAM检测通路有荧光信号增长，曲线呈S型曲线，Ct 值< 37,且R2 > 0.97 ;结果显示均符合试剂盒的质控要求，即本发明的试剂盒对待检标本 的检测结果是有效的。
[0118] 另外如图3所示，为AML1-ET0基因的特异性实验结果；针对8例包括再生障碍性 贫血、巨幼细胞遗传性贫血等其他非白血病患者样品进行Real-Time qPCR检测分析，检测 结果显示荧光扩增曲线无明显指数增长，均可明确判定为阴性。
[0119] 如图4所示，为8份白血病患者的样本的检测结果；8个样品的Ct值分别是25. 52、 26. 19、26. 60、31. 61、30. 71、30. 19、30. 90、30. 14,结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够 判定为阳性。
[0120] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种检测融合基因 AML1-ET0 mRNA表达的试剂盒，其特征在于包括：(a) RNA提取试 齐[J、AML1-ET0反应液、ABL反应液、一步法PCR酶系、AML1-ET0阳性定量参考品1-5、ABL阳 性定量参考品1-4和DEPC水；(b)分隔并集中包装上述试剂的试剂管的包装盒； 所述的RNA提取试剂包括5X的红细胞裂解液、RNA提取液-Trizol试剂、氯仿、异丙 醇和DEPC乙醇； 所述的AML1-ET0反应液包括正向引物、反向引物、AML1-ET0的寡核苷酸探针、PCR反应 缓冲液，其中AML1-ET0反应液中正向和反向引物分别是： 5' -GGATGGGCCCCGAGAAC-3'（SEQ ID N0:1); 5' -GTCAGCCTAGATTGCGTCTTCA-3' （SEQ ID N0:2); AML1-ET0 的寡核苷酸探针是：5' -X-TCGAAATCGTACTGAGAAGCACTCCA-Y-3'（SEQ ID NO:3)，其中X表示的是荧光报告基团，Y表示的是荧光淬灭基团； 所述的ABL反应液包括正向引物、反向引物、ABL的寡核苷酸探针、PCR反应缓冲液，其 中ABL反应液中正向和反向引物分别是： 5' -GACGTCTGGGCATTTGGAGTA-3' （SEQ ID N0:4) 5' -TCATACACCTGGGACAGGTCAA-3' （SEQ ID N0:5) ABL的寡核苷酸探针是：5'-X-ATGGCATGTCCCCTTACCCGGGA-Y-3'（SEQIDN0:6)，其中 X表不的是突光报告基团，Y表不的是突光淬灭基团； 所述的AML1-ET0阳性定量参考品1-5为均含有浓度为1 X 103拷贝/5 μ L?1 X 107拷 贝/5 μ L·的AML1-ET0目的片段的重组质粒；所述的ABL·阳性定量参考品1-4为均含有浓度 为1 X 103拷贝/5 μ L?1 X 106拷贝/5 μ L的ABL目的片段的重组质粒。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的AML1-ET0反应液和ABL反应液 中的PCR缓冲液包含10mmol/L的Tris-HCl缓冲液、50mmol/L的KC1溶液和3. Ommol/L的 MgCl2溶液。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述一步法PCR酶系包括逆转录酶、热 启动Taq酶、RNA酶抑制剂、dNTPs以及酶稀释液。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的AML1-ET0反应液中引物和探针 所用的浓度均为2?lOpmol/人份。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的ABL反应液中引物和探针所用 的浓度均为2?lOpmol/人份。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的待检样本是外周血或骨 髓。
7. 根据权利要求1?6任一项所述的试剂盒的检测方法，其特征在于：包括以下步骤： (1) 标本米集 标本采集：抽取受检者静脉血或骨髓3?5ml，注入含乙二胺四乙酸二钠或枸橼酸钠抗 凝剂的采血管，立即轻缓颠倒采血管混合5?10次，使抗凝剂与静脉血或骨髓充分混匀，密 闭待用； (2) 核酸提取 (a)先将5 X的红细胞裂解液用无菌纯化水稀释得到IX的红细胞裂解液；(b)取5mL 洁净离心管加入抗凝血2mL;(c)向离心管中加入2mL IX的红细胞裂解液，盖紧管盖，漩涡 振荡15s以充分混勻，室温放置3min ; (d)室温下6000rpm离心5min，去上清，保留沉淀；（e) 重复步骤（c)和（d)，尽可能吸除残存液体；(f)向离心管中加入lmL RNA提取液-Trizol 试剂，盖紧管盖，漩涡振荡15s以充分混匀，再将其转移至1. 5mL离心管并静置5min ; (g)继 续向离心管中加入200yL氯仿，盖紧管盖，用力上下振摇15s，15?30°C静置3min，4°C条 件下12000rpm离心15min，离心后得到酚-氯仿下层、中间层及无色水相上层；(h)小心吸 取400 μ L上层水相转移到另一洁净离心管中，加入500 μ L异丙醇，盖紧管盖，上下颠倒3 次，15-30°C条件下静置lOmin，然后4°C条件下12000rpm离心lOmin离心后可见白色胶状 RNA沉淀，去上清；（i)加入向离心管中加入lmL 75%的DEPC乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，4°C 条件下12000rpm离心5min，小心吸去大部分DEPC乙醇，短暂离心，再吸去剩余DEPC乙醇， 打开离心管盖将沉淀在室温空气中干燥5min以使痕量乙醇挥发；（j)用50 μ L DEPC水溶 解沉淀，室温静置2min，RNA溶液可立即进行PCR或存于-70± 10°C备用； (3) PCR检测 (a) 配置体系 AML1-ET0反应体系：将3 μ L反应酶系和17 μ L AML1-ET0反应液充分混合，然后分装 20 μ L至若干PCR反应管； ABL反应体系：将3 μ L反应酶系和17 μ L ABL反应液充分混合，然后分装20 μ L至若 干PCR反应管； (b) 加样、扩增 往上述装有AML1-ET0反应体系的不同的反应管中分别加入提取后的待测核酸5 μ L、 阴性对照品-DEPC水5 μ L和AML1-ET0阳性定量参考品5 μ L，往上述装有ABL反应体系的 不同的反应管中分别加入提取后的待测核酸5 μ L、阴性对照品-DEPC水5 μ L和ABL阳性定 量参考品5 μ L，各自盖紧反应管盖，SOOOrpm离心数秒后转移至PCR扩增仪进行扩增，扩增 完成后收集荧光信号，并保存检测数据文件； (c) 结果分析 按对应顺序设置AML1-ET0的5个阳性定量参考品，Task中设为Standard，Quantity中 设为对应的拷贝数，然后根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold 值，使"Standard curve"窗口下的标准曲线图达到最佳，即R2值彡0.97,最后到"Import" 窗口下记录仪器自动分析计算出的AML1-ET0未知标本的拷贝数，将该结果导出，然后重新 按对应顺序设置ABL的4个阳性定量参考品，步骤同前，将ABL未知标本的拷贝数导出； (4) 结果判定 如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值为空白，则判所检测的基因表达量小于检测限度； 如果增长曲线呈S型曲线且ABL的Ct值< 35，则样品的AML1-ET0/ABL表达量为 AMLl-ETO-Qty/ABL-Qty。
8. 根据权利要求7所述的试剂盒的检测方法，其特征在于：所述的AML1-ET0阳性定量 参考品1-5为均含有浓度为1 X 103拷贝/5 μ L?1 X 107拷贝/5 μ L的AML1-ET0目的片段 的重组质粒；所述的ABL阳性定量参考品1-4为均含有浓度为1 X 103拷贝/5 μ L?1 X 106 拷贝/5 μ L的ABL目的片段的重组质粒。
9. 根据权利要求8所述的试剂盒的检测方法，其特征在于：所述标本在2?8°C条件下 保存不应超过48小时；或者保存在-20±5°C待测，保存期为1个月；或者使用红细胞裂解 液处理全血或骨髓，获得有核细胞沉淀后加入lml RNA提取液，振荡混匀，于-70± 10°C保 存1个月；避免反复冻融。
10.根据权利要求9所述的试剂盒的检测方法，其特征在于，用于PCR扩增的反应温度 和时间为：50°C逆转录15min，l个循环；95°C 15min，l个循环；最后94°C 15s，55°C 45s，40 个循环。
【文档编号】C12Q1/68GK104195255SQ201410455526
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月9日 优先权日:2014年9月9日
【发明者】徐伟杰 申请人:广州蓝吉生物技术有限公司