检测eapp基因表达的试剂在诊治阿尔茨海默病中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体地设及人EAPP基因在阿尔茨海默病的诊断、治疗 中的用途。
【背景技术】
[0002] 阿尔茨海默病（Alzheimer' S disease, AD)又称老年痴呆症，是一种严重人类健 康的神经退行性疾病。临床W进行性记忆力减退、认知功能障碍和行为异常为特征，W脑萎 缩、脑内出现老年斑和神经原纤维缠结、神经元丢失为其病理特征。
[000引 目前已知，各种类型的痴呆至少有32种，而其中AD就占了其发病率的50~60% 之多。根据流行病学调查发现，目前全世界有2500万W上的AD患者。2008年美国AD病人 估计达到520万，65岁及65岁W上（13% )人群8个中就有1个为AD患者，每71秒就有1 个人染上AD，到中世纪则每33秒就有1人成为AD患者，不包括护理费每年用于治疗AD的 直接费用超过了 1480亿美元。在我国通过严格统计学抽样方法抽取城乡不同生活环境的 老年人群样本进行统计分析，结果表明，我国AD的患病率并不比西方国家低，属于AD重灾 区。AD患者通常被确诊后，平均可活8~10年，有的达20年，因此每年用于治疗AD化及康 复护理的花费和给病人家属带来的精神负担使得AD已成为21世纪许多家庭不得不面对的 灾难，由此带来的社会、经济、家庭和社会公共卫生问题也日益突出。
[0004] 由于AD的病因和发病机制尚不明确，目前没有特效方法逆转和阻止病情进展，因 此目前主要通过早期进行对症治疗，而目前临床诊断的AD患者基本都处于中晚期，现有的 治疗仅能改善症状，并不能组织或者逆转疾病的进展。因此，对其进行早期诊断和干预，能 显著减少AD的危害，从而减轻社会和家庭的负担。
【发明内容】
阳0化]为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于阿尔茨海默病早期 诊断的分子标志物。相比传统的阿尔茨海默病的诊断方法，使用基因标志物来诊断阿尔茨 海默病的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风 险高低，采取相应的预防和治疗措施。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种人EAPP基因及其表达产物在制备诊断阿尔茨海默病的产品中 的应用。
[0008] 进一步，上面所提到的诊断产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位 杂交或忍片检测EAPP基因及其表达产物的表达水平W诊断阿尔茨海默病的产品。
[0009] 进一步，所述用RT-PCR诊断阿尔茨海默病的产品至少包括一对特异扩增EAPP基 因的引物；所述用实时定量PCR诊断阿尔茨海默病的产品至少包括一对特异扩增EAPP基因 的引物；所述用免疫检测诊断阿尔茨海默病的产品包括：与EAPP蛋白特异性结合的抗体； 所述用原位杂交诊断阿尔茨海默病的产品包括：与EAPP基因的核酸序列杂交的探针；所述 用忍片诊断阿尔茨海默病的产品包括：蛋白忍片和基因忍片；其中，蛋白忍片包括与EAPP蛋白特异性结合的抗体，基因忍片包括与EAPP基因的核酸序列杂交的探针。
[0010] 优选地，所述产品包括忍片、试剂盒。 W11] 本发明还提供了人EAPP基因在高通量测序平台中的应用。随着高通量测序技术 的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常 人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知人 EAPP基因的异常与阿尔茨海默病相关也属于人EAPP基因的用途，同样在本发明的保护范 围之内。
[0012] 本发明还提供了人EAPP基因及其表达产物在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的 应用。
[0013] 进一步，所述药物包括：含有人EAPP基因的药物、携带人EAPP基因的载体或宿主 细胞所形成的药物、人EAPP蛋白质药物、或其他能够促进EAPP基因表达的药物。本发明的 药物可W用于补充内源性的人EAPP蛋白的缺失或不足，通过提高人EAPP蛋白的表达，从而 治疗因人EAPP蛋白缺乏导致的阿尔茨海默病。
[0014] 本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、 粘粒、隧菌体、病毒等。
[0015] 在本发明中，术语"宿主细胞"包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的 例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物 细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CH0细胞、cos细胞等。
[0016] 进一步，本发明的药物还包括药学上可接受的载体，载体，运类载体包括（但并不 限于）：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、薦糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明 胶和聚乙締化咯烧酬；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸巧和碳酸氨钢；吸收促进剂季锭 化合物；表面活性剂如十六烧醇；吸附载体如高岭±和皂粘± ;润滑剂如滑石粉、硬脂酸巧 和儀、聚乙二醇等。
[0017] 本发明的药物导入组织或者细胞的方式可W分为体外或者体内的方式。体外方式 包括将含有人EAPP基因的药物或者含有人EAPP蛋白质的药物导入细胞中，再将细胞移植 或回输到体内。体内方式包括直接将含有人EAPP基因的药物或者含有人EAPP蛋白质的药 物注入体内组织中。
[0018] 本发明的药物还可与其他治疗阿尔茨海默病的药物联用，多种药物联合使用可W 大大提到治疗的成功率。
[0019] 本发明还提供了一种诊断阿尔茨海默病的忍片，所述忍片包括基因忍片、蛋白质 忍片；所述基因忍片包括固相载体W及固定在固相载体的寡核巧酸探针，所述寡核巧酸探 针包括用于检测EAPP基因转录水平的针对EAPP基因的寡核巧酸探针；所述蛋白质忍片包 括固相载体W及固定在固相载体的EAPP蛋白的特异性抗体。
[0020] 进一步，所述基因忍片可用于检测包括人EAPP基因在内的多个基因（例如，与阿 尔茨海默病相关的多个基因）的表达水平。所述蛋白质忍片可用于检测包括人EAPP蛋白 在内的多个蛋白质（例如与阿尔茨海默病相关的多个蛋白质）的表达水平。通过将多个与 阿尔茨海默病的标志物同时检测，可大大提高阿尔茨海默病诊断的准确率。
[0021] 本发明提供了一种诊断阿尔茨海默病的试剂盒，所述试剂盒包括基因检测试剂盒 和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测EAPP基因转录水平的试剂；所 述蛋白免疫检测试剂盒包括EAPP蛋白的特异性抗体。
[0022] 进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或忍片方 法检测EAPP基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对EAPP基因的引 物和/或探针。根据EAPP基因的核巧酸序列容易设计出可W用于检测EAPP基因表达水平 的引物和探针。
[0023] 与EAPP基因的核酸序列杂交的探针可W是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它 衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核巧酸序列特异性结合， 任何长度都可W。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针 的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度 对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一 般不超过30个碱基对，与目的核巧酸序列互补的长度W 15-25个碱基对最佳。所述探针自 身互补序列最好少于4个碱基对，W免影响杂交效率。
[0024] 进一步，所述EAPP蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述EAPP 蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰（例如，，嵌合抗体、scFv、 Fab、F(ab')2、Fv等。只要所述片段能够保留与EAPP蛋白的结合能力即可。用于蛋白质 水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可W使用任何方法来制备所述抗 体。 阳0巧]在本发明的上下文中/'EAPP基因"包括人EAPP基因W及人EAPP基因的任何功能 等同物的多核巧酸。EAPP基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中EAPP基因 (NC_000014. 9)DNA序列具有70% W上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
[0026] 优选地，EAPP基因的编码序列包括W下任一一种DNA分子：
[0027] (1)序列表中沈Q ID NO. 1所示的DNA序列；
[002引 似在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
[0029] 做与（1)或似限定的DNA序列具有70%、优选地，90%W上同源性，且编码相 同功能蛋白质的DNA分子。
[0030] 在本发明的具体实施方案中，所述EAPP基因的编码序列是SEQ ID NO. 1所示的 DM序列。
[0031] 在本发明的上下文中，EAPP基因表达产物包括人EAPP蛋白化及人EAPP蛋白的部 分肤。所述EAPP蛋白的部分肤含有与阿尔茨海默病相关的功能域。
[0032] "EAPP蛋白"包括人EAPP蛋白化及