一种检测阿尔茨海默病外周血蛋白标志物的诊断试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及一种检测阿尔茨海默病外周血蛋白标志物的诊断试剂盒及其检测方法，属于体外诊断检测技术领域。

背景技术：

阿尔茨海默病(ad)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。由于阿尔兹海默是一种发病进展缓慢，随着时间不断恶化且不可逆的中枢神经系统退行性疾病，患者通常会从早期的近期记忆减退发展到丧失身体机能，最终导致死亡。ad不但直接威胁生命，还造成生活质量严重下降，连带的劳动力丧失和护理成本更是不可计量；加上近十年来，针对ad治疗的十项大型iii期临床试验均告失败，对于ad的药物研发来说更是雪上加霜。因此，近年来ad的研究方向逐渐转向了临床前期ad，科研人员希望通过在出现ad症状前找到能提示ad的生物标志物，从而开发预防和减缓ad的药物干预措施。ad的生物标志物(以下简称为“ad标志物”)不仅能够准确诊断阿尔茨海默病，还能指导临床治疗和疗效的监测，判断阿尔茨海默病的预后。

目前已有脑脊液中β-淀粉样蛋白(amyloid-β)和微管相关蛋白(tau)作为ad的公认生物标志物，但是由于其需要侵入性采样手段，在临床应用有限。因此，各种不同类型的血清ad标志物的联合并行检测已成为必然，而多指标并行检测的高通量迅速性、准确性和稳定性就更加至关重要。

目前，对于ad标志物的测定已有多种检测方法，包括免疫荧光分析、酶联免疫分析(elisa)、放射免疫分析(ria)、磁分离酶联免疫分析(eima)等。但是这些技术一次只能针对一种标志物进行检测，且操作繁琐、灵敏度较差，不能真正满足临床诊断检测的需要。而固相生物芯片技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐等缺点。

液相芯片技术(xmap))是一种可广泛应用于蛋白质、基因、受体/配体等多种生物反应的生物芯片技术平台，主要包括微球、探针分子、被检测物和报告分子四种成分。在微球的制造过程当中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这三种荧光的比例不同，把球形基质分为500种，可以标记上500种不同的探针分子，能同时对一个样品中多达500种不同的目标分子进行检测。反应过程中，探针和报告分子都分别与目标分子特异性结合。反应结束后，使单个的微球通过检测通道，使用红、绿双色激光同时对微球上的红色分类荧光和报告分子上的绿色报告荧光进行检测，可确定所结合的检测物的种类和数量。

本发明基于液相芯片技术的高灵敏度、高通量、检测迅速等突出优点，对ad的多种外周血蛋白标志物进行并行检测，能够在临床检测上得到更好的应用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测阿尔茨海默病外周血蛋白标志物的诊断试剂盒及其检测方法，该检测方法及试剂盒包括针对complementc4、sap、bdnf、cathepsind、ncam、pai-1、agt、opn和ssod2等九种ad标志物的联合并行检测，具有高灵敏度、高特异性、稳定性好、检测迅速等优点。

本发明的技术方案，一种检测多种阿尔茨海默病相关蛋白标志物的诊断试剂盒，主要包括以下组分：

(1)偶联抗体的微球：含有9种偶联了捕获抗体的羧基微球(微球编号为63、44、15、22、55、76、26、64和39)，即分别是：偶联了complementc4捕获抗体的微球63，偶联了sap捕获抗体的微球44，偶联了bdnf捕获抗体的微球15，偶联了cathepsind捕获抗体的微球22，偶联了ncam捕获抗体的微球55，偶联了pai-1捕获抗体的微球76，偶联了agt捕获抗体的微球26，偶联了opn捕获抗体的微球64，偶联了ssod2捕获抗体的微球39，每种捕获抗体分别抗一种ad标志物并且偶联于不同编号的微球，形成“捕获抗体—微球”的二联复合体；

(2)生物素标记的检测抗体：含有生物素标记的complementc4检测抗体，生物素标记的sap检测抗体，生物素标记的bdnf检测抗体，含有生物素标记的cathepsind检测抗体，含有生物素标记的ncam检测抗体，含有生物素标记的pai-1检测抗体，含有生物素标记的agt检测抗体，含有生物素标记的opn检测抗体，含有生物素标记的ssod2检测抗体，其中，所述的每一种检测抗体分别抗一种相应的ad标志物且对应于捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该生物标志物的不同抗原表位；

(3)链霉亲和素—藻红蛋白(streptavidin-pe)：其中链霉亲和素可与生物素特异性结合，形成带藻红蛋白(pe)荧光素标记的检测抗体，通过液相芯片仪的绿色激光激发藻红蛋白进行荧光检测；

(4)标准品：包含各种ad的生物标志物(抗原)的标准品；

(5)质控品：包含阳性对照和阴性对照。

其中所述的捕获抗体和检测抗体是针对以下9种可以自由组合的ad标志物的捕获抗体和检测抗体：complementc4，sap，bdnf，cathepsind，ncam，pai-1，agt，opn，ssod2。

一种阿尔茨海默病蛋白标志物的液相芯片联合并行检测方法，包括以下步骤：

(1)将不同编号的、表面羧基修饰的微球(beads，编号分别为63、44、15、22、55、76、26、64和39)活化后，使相应的捕获抗体(抗ad标志物的抗体)与相应的微球偶联，形成“捕获抗体-微球”二联复合体，所述的每一种捕获抗体分别抗一种ad标志物，从而使待测样品中的ad标志物与捕获抗体形成“ad标志物-捕获抗体-微球”三联复合体；

(2)将不同的检测抗体进行生物素(biotin)标记，其中所述的每一种检测抗体分别抗一种ad标志物且对应于捕获抗体，并与捕获抗体分别结合于该标志物的不同抗原表位；

(3)将步骤(1)形成的三联复合体与步骤(2)中的含有生物素标记的检测抗体混合，从而形成“生物素标记的检测抗体-ad标志物-捕获抗体-微球”四联复合体；

(4)将步骤(3)中的四联复合体与链霉亲和素-藻红蛋白(streptavidin-pe)结合后，检测出不同微球的荧光信号，从而确定待检测样品中各种ad标志物的存在及含量。

以上所述检测方法，还包括步骤：将步骤(4)中测定的可检测荧光信号与标准曲线进行比较，从而确定待检测样品中各种ad标志物的含量。

所述的微球是平均直径为5.6μm，且结合了不同荧光染料的聚苯乙烯磁性微球，即色彩编码微球(color-codedbeads)。

所述步骤(1)中的微球活化是指微球在由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)溶液、n-羟基硫代琥珀酰亚胺(s-nhs)溶液和活化缓冲液组成的三者混合液中进行活化，其中，三者混合液的用量比是：当微球数量为2.5×10⁶个时，需要50mg/mledc溶液10μl∶50mg/mls-nhs溶液10μl∶100mmnah2po4、ph6.3的活化缓冲液80μl，混合液的用量可以根据微球的数量进行相应的调整。

所述的捕获抗体和检测抗体是针对以下9种可以自由组合的ad标志物的捕获抗体和检测抗体：complementc4，sap，bdnf，cathepsind，ncam，pai-1，agt，opn，ssod2。

检测方法中所述的步骤(4)中用液相芯片法(xmap)进行检测，所述的可检测荧光信号是红色激光激发的微球上的红色分类荧光信号和绿色激光激发的藻红蛋白所产生的报告荧光信号。

本发明的一种检测阿尔茨海默病蛋白标志物的诊断试剂盒可用于检测体外样品中ad标志物的存在及含量。

本发明的有益效果：本发明制备的诊断试剂盒可用于检测体外样品中ad标志物的存在及含量。由于本发明利用了液相芯片技术，使检测方法及试剂盒具有高灵敏度、高特异性、高通量、稳定性好、检测迅速、准确等突出优点，能够对多种阿尔茨海默病相关蛋白标志物同时进行定性和定量检测，能在临床检测上得到更好的应用。

附图说明

图1是本发明中检测ad患者与正常对照组中complementc4的浓度。

图2是本发明中检测ad患者与正常对照组中sap的浓度分布图。

图3是本发明中检测ad患者与正常对照组中bdnf的浓度分布图。

图4是本发明中检测ad患者与正常对照组中cathepsind的浓度分布图。

图5是本发明中检测ad患者与正常对照组中ncam的浓度分布图。

图6是本发明中检测ad患者与正常对照组中pai-1的浓度分布图。

图7是本发明中检测ad患者与正常对照组中agt的浓度分布图。

图8是本发明中检测ad患者与正常对照组中opn的浓度分布图。

图9是本发明中检测ad患者与正常对照组中ssod2的浓度分布图。

图10是本发明9种蛋白鉴别ad痴呆与正常老年人的roc曲线分析。

图11是本发明中ad患者与正常对照组9种蛋白组合分的分布图。

图12是9种蛋白组合分鉴别ad痴呆和正常老年人的敏感性和特异性。

具体实施方式

实验材料：

本发明所用的9种ad标志物(抗原)及相应抗体来源于rnd、cellsciences和abcam公司；

不同编号的磁性微球(表面羧基修饰)、链霉亲和素-藻红蛋白均购置于qiagen公司；

1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基硫代琥珀酰亚胺(s-nhs)和n-羟基硫代琥珀酰亚胺生物素(s-nhs-biotin)购置于pierce公司。

缓冲液配制：

活化缓冲液(activationbuffer)：100mmnah2po4，ph6.3；

偶联缓冲液(couplingbuffer)：50mmhepes，ph7.4；

磷酸缓冲液(pbs)：10mmnah2po4，150mmnacl，ph7.4。

实施例1：9种阿尔茨海默病标志物的液相芯片联合并行检测方法，具体的检测方法包括如下步骤：

1.所需微球的活化

1.1全速涡旋微球储存液至少3min，形成均一的微球悬液；

1.2分别称取10mg的edc和s-nhs到两个离心管中；

1.3用去离子水溶解使其终浓度为50mg/ml；

1.4取1ml的微球悬液10000g离心3min，小心移除上清；

1.5加入80μl的活化缓冲液将微球重悬；

1.6分别加入10μl的edc溶液(50mg/ml)和10μl的s-nhs溶液(50mg/ml)，混合均匀，室温(15-25℃)，避光，振荡孵育20min。

2.相应的捕获抗体与活化的微球偶联

2.1用偶联缓冲液将捕获抗体稀释成体积为500μl，浓度为0.1mg/ml的溶液；(抗体溶液中不能含有外源蛋白，叠氮化物，氨基乙酸，tris或其他任何含有氨基的试剂。如果含有这些试剂，通过透析或凝胶过滤层析除去)。

2.2将微球在10000g离心3min，小心移除上清；

2.3加入步骤2.1中已经稀释好的抗体溶液(500μl)；

2.4将活化的微球与抗体溶液，在室温(15-25℃)下，避光，振荡孵育2h(离心管必须用锡纸包裹避光)；

2.5将微球在10000g离心3min，小心移除上清；

2.6加入500μlpbs将微球重悬，10000g离心3min，小心移除上清；

2.7加入1mlpbs/1％bsa(bsa：牛血清白蛋白)将微球重悬；

2.8通过血小板计数器对微球计数；

3.生物素标记检测抗体

3.1将生物素试剂(s-nhs-biotin)从冰箱的冷藏室中取出，在室温下平衡，使其恢复到室温；

3.2依据检测抗体的浓度，用pbs将抗体稀释到1mg/ml；

3.3用超纯水配置10mm的生物素溶液；

3.4按摩尔比1∶20(抗体∶生物素)，计算生物素所需要的量，加入到浓度为1mg/ml的抗体溶液中；

计算公式：

3.5将反应液在冰上孵育2h，或是在室温孵育30min；

3.6将反应液转移到透析盒，除去其中未反应的s-nhs-biotin。

4.抗原标准品的配置：complementc4按1000，250，62.5，15.6，3.9，0.9，0.2ng/ml的浓度进行配制，sap按500，125，31.2，7.8，1.9，0.4，0.1ng/ml的浓度进行配制，bndf和pai-1按10000，2500，625，156，39，10，2pg/ml的浓度进行配制，cathepsind和ncam按100000，25000，6250，1563，391，98，24pg/ml的浓度进行配制，agt按1000，333，111，37，12，4，1ng/ml的浓度进行配制，opn按100，33.3，11.1，3.7，1.2，0.4,0.1ng/ml的浓度进行配制，ssod2按25，8.3，2.7，0.9，0.3，0.1,0.03ng/ml的浓度进行配制，标志物混合液分别标记为std7，std6，std5，std4，std3，std2，std1，std0。

5.偶联捕获抗体的微球混合液(i混合液)的配制：分别取偶联了9种ad标志物的捕获抗体的微球，如下列：complementc4捕获抗体微球63，偶联了sap捕获抗体的微球44，偶联了bdnf捕获抗体的微球15，偶联了cathepsind捕获抗体的微球22，偶联了ncam捕获抗体的微球55，偶联了pai-1捕获抗体的微球76，偶联了agt捕获抗体的微球26，偶联了opn捕获抗体的微球64，偶联了ssod2捕获抗体的微球39，等比例混合，使每种微球的终浓度分别为200个/μl，4℃避光保存。

6.含生物素标记的检测抗体混合液(ii混合液)的配制：分别取进行了生物素标记的complementc4检测抗体，sap检测抗体，bdnf检测抗体，cathepsind检测抗体，ncam检测抗体，pai-1检测抗体，agt检测抗体，opn检测抗体，ssod2检测抗体，加入ph7.4的pbs，使每种检测抗体的终浓度分别为10μg/ml。

7.对照品：对照品包括阳性对照和阴性对照。

8.血清样品中9种ad蛋白标志物的含量检测

8.1血清样品包括正常人血清样本101份，ad患者血清样本98份。

8.2分别加入偶联捕获抗体的微球混合液(i混合液)于96孔酶标板，25μl/孔；

8.3加入标准品(std0、std1、std2、std3、std4、std5、std6)、质控品(阳性对照和阴性对照)、病人血清样本1-98号、正常人血清样本1-101号，25μl/孔；

8.4用多孔板混匀仪混匀，盖上盖子，在4℃下避光孵育过夜；

8.5将多孔板放置在磁力架上30s，弃去每孔上清液；

8.6加入含生物素标记的检测抗体混合液(ii混合液)，25μl/孔；盖上盖子，放置于多孔板振荡器，在室温下避光孵育60min；

8.7用pbs/1％bsa将链霉亲和素-藻红蛋白稀释成浓度为200μg/ml的溶液，加稀释好的链霉亲和素藻红蛋白25μl到每个孔中，盖上盖子，放置于多孔板振荡器，在室温下避光孵育30min；

8.8在液相芯片仪(flexmap3d，luminex公司)上，对反应的混合物进行分析，利用milliplexanalyst5.0软件绘制标准曲线，并根据标准曲线计算出检测样品中9种ad蛋白标志物的含量。

8.9检测结果及分析，参见表1-3和图1-11。

(1)表1为9种血清蛋白的检测结果(中位数和范围)，组间比较显示(表1)：9种蛋白的组间差异均有统计学意义，其中ad痴呆组agt和sap含量低于正常老年组，其余7种蛋白ad痴呆组高于正常老年组。

表19种蛋白的检测结果和组间比较

(2)9种蛋白鉴别ad痴呆与正常老年人的roc曲线分析结果显示(表2，图10)：9种蛋白标志物对ad痴呆与正常老年人具有一定鉴别能力，其中agt、bdnf和ncam的敏感性和归类正确率相对较高，达到70％以上。

表29种蛋白鉴别ad痴呆与正常老年人的roc曲线分析

a.underthenonparametricassumption

b.nullhypothesis:truearea＝0.5

(3)通过判别分析建立如下判别函数，并计算判别函数分(即9种蛋白组合分)，正常对照与ad痴呆患者组合分的分布见图11。

y＝0.513agt+0.356opn+0.543sap+0.398complementc4+0.435bdnf+0.307cathepsind+0.244ncam–0.338pai-1+0.038ssod2)

自身验证、交互验证和roc曲线分析显示判别函数分鉴别ad痴呆和正常老年人具有较好的敏感性、特异性和归类正确率(表3，图12)。

表39种蛋白组合鉴别ad痴呆与正常老年人的结果

以上结果表明，用本发明方法可以同时对9种血清ad标志物进行联合并行检测。该9种血清ad标志物对ad患者与正常老年人的归类正确率为87.4％，该方法的敏感性为86.7％，特异性为88.1％。可以作为ad临床诊断检测的重要指标。

在阅读了以上关于本发明的陈述内容之后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改或变化，这些等价形式同样归属于本申请所附权利要求书中所限定的范围。