一种体外人工分离淋巴细胞及冷冻保存的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物学领域，具体设及一种体外人工分离淋己细胞及冷冻保存的方 法。
【背景技术】
[0002] 近几年国内外在4(：1研究中主要集中在树突状细胞(〇611化^^〇611，0〇、细胞因 子诱导自然杀伤细胞(切tokine-Induced化化ral Killer，CINK)、细胞因子诱导杀伤细胞 (切tokine Induced Killer,CIK)、自然杀伤细胞(Na1:ural Killer,NK)等抗肿瘤免疫效应 细胞的诱导、扩增和回输。临床获得免疫效应细胞源于患者或同属健康供者的外周血单核 细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)或骨髓细胞。由于PBMC比骨髓细胞提取 方便，患者接收度高，临床上WPBMC作为主要细胞来源。
[0003] 临床上获取PBMC有两种方式，一种是采集静脉血50ml左右，通过梯度密度法分离 获得;另一种是通过血细胞分离机获得。由于患者个体差异，有的需要多次循环收集才能达 到实验要求的细胞数，采集时间长，病人痛苦大，且产生较大的细胞总体积，至少50mlW上， 需要添加更多的冷冻保护剂，冻存和复苏流程也很复杂，且需占用更大的储存空间。机采 PBMC与手工分离提取PBM讨目比，购置仪器投入的成本和患者使用的成本均较高，每天接待 的患者数量有限，特别是仪器发生故障时PBMC的采集工作就必须中止，严重影响患者的治 疗，因此机采PBMC后进行冷冻保存对医患双方并非是一个经济实用的方案。
[0004] 有鉴于此，急需设计一种经济实用、操作简便、高活性和高复苏率的PBMC获取方 法，W获得免疫效应细胞。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是设计一种经济实用、操作简便、高活性和高复苏率 的PBMC获取方法，W获得免疫效应细胞。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是提供一种体外人工分离淋己 细胞及冷冻保存的方法，包括W下步骤：
[0007] A1、对淋己细胞进行分离：
[000引抽取10ml静脉血注入EDTA抗凝真空采血管，待血液与抗凝剂混合均匀后，在 300化pm和室溫下离屯、10分钟；
[0009] 用第一塑料己氏吸管吸取血样中上层淡黄色血浆作为自体血浆，然后在邸TA抗凝 真空采血管中加入1:1的特定培养液稀释血样；
[0010] 取15ml的第一锥形离屯、管加入5mlFicoll-Paque Plus溶液，再将稀释后的血样加 在Ficol 1-Paque Plus溶液上面，在400g加速度和室溫下离屯、30分钟；
[0011] 用第二塑料己氏吸管吸取第一锥形离屯、管中两层液体间的不透明细胞层，获得淋 己细胞，转入第二锥形离屯、管；
[0012] 在第二锥形离屯、管中加入4 °C预冷的特定培养液，与淋己细胞充分混合，250g加速 度下离屯、10分钟；
[0013] 弃上清，重悬第二锥形离屯、管中的淋己细胞于4Γ预冷的特定培养液中，重复洗涂 两次，留取细胞悬液获得纯化的淋己细胞；
[0014] A2、对纯化的淋己细胞进行冷冻保存：
[0015] 将第二锥形离屯、管中纯化的淋己细胞重悬于3ml含10%DMS0和30%自体血浆的冷 冻保存液中；
[0016] 将淋己细胞转入冻存管中，4°C平衡10分钟，然后按照rc/分钟的降溫速度进行降 溫，最后保存在-150°C的气态液氮罐中。
[0017] 在上述技术方案中，计算活细胞百分率和淋己细胞回收率的方法如下：
[001引依次在1、3、6、12、24、60个月后复苏冻存的淋己细胞，取出冻存管，迅速投入371： 水浴中，使冻存的淋己细胞完全融解；
[0019] 将冻存管中融解的淋己细胞加入含10%FBS的完全培养基中，离屯、，弃上清，重悬 淋己细胞于4°C预冷的特定培养液中；
[0020] 从复苏后得到的PBMS细胞混悬液中取出10μ1淋己细胞悬液，并在淋己细胞悬液中 加入0.4%台吩蓝染色液10μ1;
[0021] 3-5分钟后，取10μ1淋己细胞悬液与台吩蓝染色液的混合液加入到血细胞计数板， 置显微镜下观察；
[0022] 根据正常细胞体完整、透明不着色W及死细胞呈蓝色的原理，随机计数200个淋己 细胞，并计算活细胞百分率和淋己细胞回收率。
[0023] 在上述技术方案中，取冷冻保存处理前的细胞悬液进行细菌和真菌培养。
[0024] 在上述技术方案中，W均数±标准差表示计算结果，采用SPSS13.0统计学软件分 析数据。
[0025] 在上述技术方案中，
[00%]所述活细胞百分率=(活细胞数/总细胞数）Χ 100%。
[0027] 在上述技术方案中，所述活细胞百分率为(97.0 ±0.5) %。
[0028] 在上述技术方案中，所述淋己细胞回收率=(分离后淋己细胞数/分离前淋己细胞 数）Χ100%。
[0029] 在上述技术方案中，所述分离前淋己细胞数在静脉采血后进行血常规检查得到； 用Α1中洗涂后末次细胞悬液涂片，进行肥染色，区分PBMS细胞混悬液中各类型细胞并计数， 得到所述分离后淋己细胞数。
[0030] 本发明按照GMP生产要求和可回输患者体内的各种临床级试剂、材料要求，基于 Amersham FicoU-化que Plus分离淋己细胞技术和细胞冻存技术，改良并建立了一种能长 期冻存在深低溫下的高活性淋己细胞体外生产流程，通过体外人工分离淋己细胞的方法可 W获得足量的高活性淋己细胞，通过预存淋己细胞，可择机复苏、培养、回输抗肿瘤免疫效 应细胞。
【附图说明】
[0031] 图1为本发明实施例提供的一种体外人工分离淋己细胞及冷冻保存、复苏、培养的 方法流程图；
[0032] 图2为本发明实施例提供的SI的具体流程图；
[0033] 图3为本发明实施例提供的S2的具体流程图。
【具体实施方式】
[0034] 本发明通过建立体外分离高活性和高复苏率的淋己细胞冻存方法，按照人体回输 细胞的临床应用要求，改良Ficoll梯度密度离屯、法，从外周血分离淋己细胞，采用二甲基亚 讽(DMS0)作为细胞防冻剂，细胞冻存液分为含胎牛血清组和自体血浆组，将纯化的淋己细 胞保存于-150°C气态液氮罐中，在1、3、6、12、24、60个月后复苏淋己细胞，测定淋己细胞存 活率和回收率并评价效果，采用SPSS13.0统计学软件分析数据。改良的Ficoll梯度密度离 屯、法获得的淋己细胞存活率为(99.6±0.6) %，淋己细胞回收率为(66.4± 13.6) %，日处理 血量1000ml，在冻存了 1、3、6、12、24、60个月后两种细胞冻存液均使淋己细胞存活率保持在 95% W上，质量控制体系经过5年的运行，稳定可靠。通过体外人工分离淋己细胞的方法可 W获得足量的高活性淋己细胞，经长时间冷冻保存后仍可维持高活性，可根据需求即时取 出冻存的淋己细胞，可择机复苏、培养、回输抗肿瘤免疫效应细胞。
[0035] 下面结合说明书附图和【具体实施方式】对本发明做出详细的说明。
[0036] 本发明实施例提供了一种体外人工分离淋己细胞及冷冻保存、复苏、培养的方法， 用到的材料和仪器为：
[0037] 1、血样来源：外周淋己细胞来自50岁W上健康中老年志愿者的肘静脉血液，均签 署知情同意书;2、一次性无菌材料:EDTA抗凝真空采血管、塑料己氏吸管、锥形离屯、管和冷 冻管；3、无菌试剂:特定培养液(本实施例中采用RPMI1640培养液来配置）、Ficoll-Paque Plus、胎牛血清和DMS0;4、主要仪器:Class II级生物安全柜、低溫台式离屯、机、超低溫冰箱 W及气态液氮罐。
[0038] 如图1所示，体外人工分离淋己细胞及冷冻保存、复苏、培养的方法具体包括W下 步骤：
[0039] S1、对淋己细胞进行分离。
[0040] S2、对纯化的淋己细胞进行冷冻保存。
[0041] S3、依次在1、3、6、12、24、60个月后复苏胎牛血清组和自体血浆组中冻存的淋己细 胞，取出第一冻存管和第二冻存管，迅速投入37°C水浴中，使冻存的淋己细胞完全融解。
[0042] S4、将第一冻存管和第二冻存管中融解的淋己细胞分别加入含10%FBS的完全培 养基中，离屯、，弃上清，重悬淋己细胞于4°C预冷的特定培养液中。
[0043] S5、从复苏淋己细胞后得到的胎牛血清组和自体血浆组PBMS细胞混悬液中分别取 出10μ1淋己细胞悬液，并分别在两组淋己细胞悬液中加入0.4%台吩蓝染色液10μ1。
[0044] S6、3-5分钟后，分别在胎牛血清组和自体血浆组中取10μ1淋己细胞悬液与台吩蓝 染色液的混合液加入到血细胞计数板，置显微镜下观察。
[0045] S7、根据正常细胞体完整、透明不着色W及死细胞呈蓝色的原理，随机计数200个 胎牛血清组淋己细胞和200个自体血浆组淋己细胞，并计算活细胞百分率和淋己细胞回收 率。
[0046] S8、取冷冻保存处理前细胞悬液进行细菌和真菌培养。
[0047] S9、上述计算结果W均数±标准差表示，采用SPSS13.0统计学软件分析数据。
[004引如图2所示，別具体包括W下步骤：
[0049] S11、抽取10ml静脉血分别注入7ml第一抓TA抗凝真空采血管和第二抓TA抗凝真空 采血管，轻轻转动第一抓TA抗凝真空采血管和第二抓TA抗凝真空采血管，待血液与抗凝剂 混合均匀后，在3000rpm和室溫下离屯、10分钟。
[0化日]S12、用第一塑料己氏吸管吸取血样中上层淡黄色血浆3ml。
[0051 ] S13、取1:1的特定培养液分别加入到第一抓ΤΑ抗凝真空采血管和第二抓ΤΑ抗凝真 空采血管中，稀释血样。
[0化2] S14、取15ml的第一锥形离屯、管和第二锥形离屯、管，分别加入5ml的Ficoll-Paque Plus溶液，再将稀释的血样分别加在Ficoll-Paque Plus溶液上面(注意勿倾斜或晃动加完 血样的锥形离屯、管），在400g加速度和室溫下离屯、30分钟。
[0053] S15、用第二塑料己氏吸管吸取第一锥形离屯、管中两层液体之间的不透明淋己细 胞层，转入第Ξ锥形离屯、管；用第Ξ塑料己氏吸管吸取第