人类骨髓细胞处理试剂盒及细胞处理方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学，特别是一种人类骨髓细胞处理试剂盒及细胞处理方法。
【背景技术】
[0002] 随着现代科学技术的不断发展，用于人类血液细胞的分离技术也得到了长足的发 展，目前主要有W下几种处理方法；免疫磁珠法、流式细胞仪法、血细胞分离机法和培养扩 增法，上述方法存在造价高，中低收入患者不适用，对细胞本身活性有损伤，影响细胞治疗 疗效，患者承担一定的生命危险，污染率高，干细胞向未知方向分化为未知干细胞，时间长 等缺陷。
[0003] CN1948467A公开了一种用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒，其缺点是由于使用该 专利直接分离血液中的干细胞，数量不足W临床治疗使用，所W该专利进行了细胞培养，培 养的细胞污染率高，体外模拟体内环境使细胞扩增，导致培养出的细胞有形态没功能，不能 用于临床治疗；CN101144070A公开了一种骨髓厮带血干细胞体外分离试剂盒及其应用方 法，其缺点是该专利试剂中添加了 lin抗体，导致成本大大提高，投入到临床使用中后，给 中低收入患者造成负担，导致患者看不起病，接受不起细胞治疗，并且使用了 lin抗体对细 胞清洗造成了较大负担，此种物质进入人体后会发生何种变化还是未知数，还有待进一步 研究。
[0004] 综上，现有细胞分离技术主要存在W下几方面问题；1、治疗成本高。完成细胞分离 工作的仪器设备(如；血细胞分离机及流式细胞仪）价格昂贵，导致治疗成本升高，增加了患 者的治疗费用，不利于项目的推广和普及；2、细胞活性低。免疫磁珠法和流式细胞仪法筛 选出来的均是被标记了的细胞，送些分选方法均存在筛选细胞范围小、细胞负重后活性降 低W及标记物留在人体内会变成什么还是未知等问题；3、细胞液体积大。使用血细胞分离 机分离的一般为外周血，且需要采集前打2-7天动员剂，将骨髓中干细胞动员到外周血里， 经血细胞分离机处理后筛选出的细胞液体积较大，一般都超过50ml，且红细胞去除不干净。 最后得到的细胞悬液体积大、质量不佳，只能用于自体皮下注射；4、获取细胞时间过长。培 养扩增一周后才能用于临床治疗，时间过长会延误治疗的最佳时机，影响治疗效果，培养期 间造成污染率提高；5、传统的分离方法仅限于实验室及科研使用。许多分离方法操作过程 繁琐，对人员的专业要求较高，既费时又费力。从实验方法到临床应用还需要技术改进；6、 不能产业化。实验成本高、操作环节中污染机率大、细胞液的保存运输条件不备，导致提取 的细胞液数量有限，满足不了临床治疗的大量需求；另外，上述相关专利还存在原料来源复 杂、配制繁琐、对于分离哪种血液针对性不强（因为人类血和动物血细胞存在一定差异)，原 料用到质量难W控制的生物制品等缺点。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了提供一种可操作性强、临床安全性高、便于临床推广的人类 骨髓细胞处理试剂盒及细胞处理方法，该试剂盒易于存储运输、可产业化生产、使用方便快 捷。
[0006] 本发明的技术方案是： 一种人类骨髓细胞处理试剂盒，其特征在于，含有W下Η种试剂： 1号试剂为稀释剂；〇. 5%-20%氯化钢注射液或PBS液， 2号试剂为沉淀剂；0. 5%-20%居己基淀粉或甲基纤维素， 3号试剂为分层液：由聚藏糖和泛影葡胺配制成的密度为1. 0-1. 2的分层液。
[0007] -种人类骨髓细胞处理方法，其特征在于：将含有构稼酸钢抗凝液的骨髓加入到 含有20-350毫升1号试剂的大容量培养液瓶中，再加入4-200毫升2号试剂摇匀，后静置 待分层后吸取上层细胞液W 500-4000rpm离必1-20分钟，离必浓缩后用生理盐水稀释到 10-150毫升铺到1-100毫升3号液上层，然后W 500-4000巧m离必1-60分钟使分出干细胞 层，收集干细胞层后用生理盐水清洗细胞备用。
[0008] 本发明的有益效果是： 1、将试剂盒中1号2号3号试剂组合应用，利用人类各种血细胞密度不同，通过2号 试剂结合血液中红细胞等不能起到临床治疗效果的细胞，使其重量增加，沉淀到细胞培养 液瓶的底部，再利用各种细胞密度差异将它们分散于自上而下的试剂层次中去除人类骨髓 中的红细胞，血浆，血小板，血红蛋白，粒细胞等，经过本发明分离的干细胞回收率能够达到 90% W上，由于干细胞等细胞没有标记物等负重，使细胞存活率检测大于98%。
[0009] 2、1-3号试剂原料便宜，配置过程简单质量可控，具有造价低，无任何标记物，保留 原有细胞活性，细胞液体积小，干细胞种类齐全，分离操作时间短1小时左右即可完成，细 胞数量能够满足临床治疗的需要等优点。
[0010] 3、本发明试剂盒中原料简单易得，成本低廉，不使用质量难W控制的生物制品。能 够实现在最低的价格，最简便的分离方法下分离出治疗所需要的细胞的目的。
[0011] 4、本明可配有大容量培养液瓶，免除了临床现有少量多次处理细胞的繁琐过程， 大大降低了污染机率，对环境及细胞本身不会造成任何污染，是临床上迫切需要的一种分 离细胞的试剂盒及方法。
【具体实施方式】 [001引 实施例1 该人类骨髓细胞处理试剂盒，其中包含W下Η种试剂： 1号试剂为稀释剂；0. 9%氯化钢注射液或PBS液， 2号试剂为沉淀剂；6%居己基淀粉或甲基纤维素， 3号试剂为分层液：由聚藏糖和泛影葡胺配制成的密度为1. 075±0. 001的分层液。
[0013] 其中，1号试剂(稀释剂）;选用PBS液，其配制过程是先用少量水溶解下述试剂：氯 化钢4g，氯化钟0.1 g，12水磯酸氨二钢1. 445g，磯酸二氨钟0.1 g，然后加水至500ml，即得。 使用前利用5. 6%的碳酸钢调节抑至7. 2 ;2号试剂(沉淀剂);6%居己基淀粉(市售);3号试 剂(分层液）；将聚藏糖与泛影葡胺配制成比重为1. 075的分层液；将上述1号液经过10分 钟灭菌，检测其内毒素含量《0.祀U/ml，装瓶，4°C保存。3号液经过10分钟灭菌，检测其内 毒素含量《祀U/ml，装瓶。
[0014] 利用上述试剂盒对细胞处理方法；将含有构稼酸钢抗凝液的人类骨髓200ml加入 至恰有200ml的试剂1号液中，再加入150ml试剂2号液中，摇匀3分钟，放置30分钟，待 分层后吸取上层细胞液，分装至50ml离必管中，W 150化pm离必5分钟，搜集下层细胞液， 用生理盐水稀释后铺在试剂3液上，W 2000rpm离必20分钟，收集中间干细胞层后，用生理 盐水清洗3次，再用生理盐水稀释至临床使用体积即得。
[001引表1 ;实施例1中分离出的干细胞回收率 实施例2
试剂盒组成如下： 1号试剂(稀释剂）：0. 9%氯化钢注射液（即生理盐水）市售。
[0016] 2号试剂(沉淀剂）；甲基纤维素(进口）50克，加入到500毫升4°C生理盐水中，摇 匀。即得10%甲基纤维素。
[0017] 3号试剂(分层液）；将聚藏糖与泛影葡胺配制成比重为1. 075的分层液。
[001引将上述2号液经过10分钟灭菌，检测其内毒素含量《0.祀U/ml，装瓶，4°C保存。3 号液经过10分钟灭菌，检测其内毒素含量《祀U/ml，装瓶。
[0019] 将含有构稼酸钢抗凝液的人类骨髓200ml加入到含有200ml的试剂1号液中，再 加入150ml试剂2号液中，摇匀3分钟，放置30分钟，待分层后吸取上层细胞液，分装至50ml 离必管中，W 1500rpm离必5分钟，搜集下层细胞液，用生理盐水稀释后铺在试剂3液上，W 2000rpm离必20分钟，收集中间干细胞层后，用生理盐水清洗3次，再用生理盐水稀释至临 床使用体积即得。
[0020] 表2 ;实施例2中分离出的干细胞回收率_
【主权项】
1. 一种人类骨髓细胞处理试剂盒，其特征在于，含有以下三种试剂： 1号试剂为稀释剂：〇. 5%-20%氯化钠注射液或PBS液， 2号试剂为沉淀剂：0. 5%-20%羟乙基淀粉或甲基纤维素， 3号试剂为分层液：由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1. 0-1. 2的分层液。2. -种人类骨髓细胞处理方法，其特征在于：将含有枸橼酸钠抗凝液的骨髓加入到含 有20-350 _升1号试剂的大容量培养液瓶中，再加入4-200 _升2号试剂摇匀，后静置 待分层后吸取上层细胞液以500-4000rpm离心1-20分钟，离心浓缩后用生理盐水稀释到 10-150毫升铺到1-100毫升3号液上层，然后以500-4000rpm离心1-60分钟使分出干细胞 层，收集干细胞层后用生理盐水清洗细胞备用。
【专利摘要】本发明涉及一种人类骨髓细胞处理试剂盒及细胞处理方法，其特征在于，含有以下三种试剂：1号试剂为稀释剂：0.5%-20%氯化钠注射液或PBS液；2号试剂为沉淀剂：0.5%-20%羟乙基淀粉或甲基纤维素；3号试剂为分层液：由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1.0-1.2的分层液。将含有枸橼酸钠抗凝液的骨髓加入到含有1号试剂的大容量培养液瓶中，再加入2号试剂摇匀，后静置待分层后吸取上层细胞液离心1-20分钟，离心浓缩后用生理盐水稀释并铺到3号液上层，然后离心使分出干细胞层，收集干细胞层后用生理盐水清洗细胞备用。其可操作性强、临床安全性高、便于临床推广，该试剂盒易于存储运输、可产业化生产、使用方便快捷。
【IPC分类】C12N5/0775
【公开号】CN105670991
【申请号】
【发明人】杨淑芬
【申请人】杨淑芬
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2014年11月19日