一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料的制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学工程技术领域，具体涉及一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料的制备方法，及其应用。
【背景技术】
[0002]糖尿病是危害人类身心健康的主要慢性疾病之一，重建糖尿病患者体内的功能性胰岛细胞功能是治疗糖尿病的理想目标。恢复糖尿病患者体内胰岛功能的主要有3种途径:胰腺移植、胰岛移植及干细胞移植。由于供体来源缺乏、移植后排斥反应等不足，胰腺移植和胰岛移植方案在临床上的推广应用受到限制，使干细胞移植成为替代治疗的研究重点。骨髓间充质干细胞因具有多向分化潜能、免疫原性弱、不存在伦理争议等优势，成为干细胞移植治疗糖尿病的一种理想细胞来源。
[0003]国内外学者均采用骨髓间充质干细胞定向分化成胰岛β细胞对I型糖尿病患者进行了探索性的治疗研究，发现在治疗后患者的胰岛细胞功能有显著提高。然而，目前的干细胞定向分化仍然存在几大问题:其一是分化效率较低，无法产生足够数量的胰岛素分泌细胞；其二诱导分化形成的胰岛素分泌细胞寿命较短；其三是胰岛素分泌细胞没有高糖反应性，即血糖升高时，胰岛素分泌细胞无法反应性增加胰岛素的分泌。
[0004]随着组织工程学的发展，将干细胞与可降解的生物材料相结合，最终形成模拟胰腺功能的替代组织成为了可能。目前组织工程的研究仍处于初级阶段，还有很多问题需要解决:首先是材料的筛选，即如何筛选出适合胰腺组织构建的理想的生物材料；再次是生物材料与干细胞结合后，干细胞正常生理特性的维持。其中材料问题是首先要解决的基本问题。
[0005]目前国内外关于干细胞与生物材料相结合诱导分化形成胰岛素分泌细胞的文献报道甚少。
【发明内容】
[0006]本发明目的在于提供一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料及其制备方法，本发明的另一目的在于提供该组织工程材料在促进骨髓间充质干细胞定向分化胰岛细胞中的应用。
[0007]本发明的主要技术方案是在聚乳酸轻基乙酸(Poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)支架上诱导分化骨髓间充质干细胞定向分化形成胰岛β细胞，为治疗糖尿病提供合适移植来源。
[0008]本发明选用一种能够支持细胞的增殖、分化和生物合成的PLGA支架，具有生物可降解性、良好的生物相容性、可加工性等优点。PLGA是一种可降解的生物支架材料，但在体外培养条件下随着培养环境的改变和时间的推移会逐渐的萎缩和降解。而且骨髓间充质干细胞在PLGA上的生长是否良好亦受种植的时间、浓度、方式很大的影响。因此，控制骨髓间充质干细胞种植的时间、浓度、方式以及支架材料的大小、形状等，是应用PLGA支架诱导分化形成胰岛β细胞的关键。
[0009]本发明的第一方面，是提供一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料的制备方法，该制备方法包括如下步骤:
[0010]用NaCl颗粒制孔或浸出法制备多孔PLGA支架，具体步骤如下:
[0011]将聚乳酸轻基乙酸(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)，其中聚乳酸(PLA):羟基乙酸(PGA)体积比为85:15，溶于1，4 二氧六环溶液中，配制成PLGA浓度为10% (w/V)的溶液，PLGA的分子量15KD。向上述浓度为10% w/v的聚乳酸羟基乙酸溶液中加入粒径大小为100?250 μ m，比例为25% -75% (w/w)的NaCl颗粒，优选粒径为150?200 μ m，比例为50% (w/w)的NaCl颗粒，搅拌后得到均匀悬液，倒入尺寸为8cmX8cm的培养皿。室温下干燥24小时以上(最佳为48h)，冷冻干燥24小时以上(最佳为48h)。脱模后用蒸馏水滤去多孔膜中的NaCl，室温干燥24小时以上(最佳为48h)，搅拌烧杯中的去离子水可加速NaCl颗粒的溶出，待NaCl颗粒完全溶出后干燥薄膜，密封保存，得到可用于骨髓间充质干细胞培养的多孔PLGA支架。
[0012]经实验证明，大鼠骨髓间充质在不同孔径和孔径率PLGA支架上向胰岛β的诱导分化，扫描电镜观察支架和细胞形态、实时定量PCR检测Insl基因的表达，得出适应骨髓间充质干细胞培养的PLGA支架。
[0013]本发明的第二方面，是提供根据上述的制备方法制备得到的用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料。
[0014]本发明的第三方面，是提供了上述的组织工程材料在促进骨髓间充质干细胞定向分化胰岛细胞中的应用。
[0015]该应用包括:
[0016]利用上述的组织工程材料促进骨髓间充质干细胞定向分化胰岛β细胞的方法；
[0017]本发明还提供了一种利用上述的组织工程材料(即多孔PLAG支架)诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化成胰岛β细胞的方法，具体方法如下:
[0018]Α.大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定
[0019]全骨髓贴壁培养法分离法获取大鼠骨髓间充质干细胞。(具体方法参见SoleimaniM, Nadri S.A protocol for isolat1n and culture of mesenchymal stem cells frommouse bone marrow.Nat Protoc.2009 ；4:102 - 106.)，具体步骤为:将大鼠麻醉后处死，置于75%酒精中浸泡15min。分离股骨和胫骨，PBS冲洗后，剪去干骺端，2ml医用注射器吸取培养基冲洗骨髓腔。将悬液过滤后，2000rpm/minX 5min离心，沉淀吹打混勾后种于培养瓶中培养。骨髓间充质干细胞贴壁率达到70%后传代。
[0020]传至第三代(P3)后对培养获取的骨髓间充质干细胞分别进行形态学、表面标志物、功能鉴定。
[0021]B.大鼠骨髓间充质干细胞在多孔PLAG支架表面进行诱导分化
[0022]取P3代大鼠骨髓间充质干细胞，将细胞接种到上述制备方法得到的已消毒的多孔PLGA支架表面，细胞接种密度为2.5 X 15个/24孔大小支架或4.5 X 104个/96孔大小支架，24小时后将普通培养液(aMEM+10%FBS)换为胰岛β细胞诱导液，胰岛β细胞诱导液AdmL培养基/24孔板或者0.1mL培养基/96孔板)诱导10天后更换胰岛β细胞诱导液B (ImL培养基/24孔板或者0.1mL培养基/96孔板)继续诱导10天，每3天换液一次；其中胰岛β细胞诱导液Α:含有10%FBS，1%非必需氨基酸，30ng/ml表皮生长因子(EpidermalGrowth Factor, EGF)，3% B27，30ng/ml 成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor, bFGF)，3mmol/L L-谷氨酰胺(L-glutamine)的 a MEM。胰岛 β 细胞诱导液 B:含10% FBS，10ng/ml β -动物纤维素(β -celIulin)，lOng/ml 激活素 A(activin A), 2% B27，lOmmol/L 尼克酰胺和 30ng/ml 成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的a MEM(以上百分比均为体积百分比)。
[0023]其中步骤B中的普通培养基为a MEM+10% FBS (完全培养基组分参见SoleimaniM, Nadri S.A protocol for isolat1n and culture of mesenchymal stem cells frommouse bone marrow.Nat Protoc.2009 ；4:102 - 106.)。
[0024]其中24孔板每孔加入的普通培养液的量为lmL，96孔板每孔加入的普通培养液的量为0.1mL0
[0025]通过大鼠骨髓间充质干细胞-PLGA支架冰冻切片、扫描电镜观察、RT-PCR、免疫荧