变(图8，C)。诱导15天后，很多细胞伸出细胞突触在细胞单层上面互相连接，细胞增殖、分化成三维组织样结构(图8，E)。NaCl颗粒粒径大小为150?200 μ m、比例为50% (w/w)制备的PLGA支架比单层培养体系有更多的表面积供细胞粘附并为细胞克隆的扩增和增殖提供更加充足的空间有关。
[0063]4.RT-PCR及其产物的半定量分析PDX1，Ngn3，胰高血糖素(Glucagon)，胰岛素(insulin)，葡萄糖车专运蛋白 2 (glucose transporter 2，Glut2)
[0064]结果显示接种在PLGA支架的大鼠骨髓间充质干细胞用胰岛β细胞诱导液诱导7d后表达胰岛β细胞特异性基因较单层细胞培养组显著增高(Ρ〈0.01)(图9)。表明NaCl颗粒粒径大小为150?200 μπκ比例为50% (w/w)制备的PLGA支架能够更好地模拟体内微环境，PLGA支架的三维结构可能比单层培养体系更利于大鼠骨髓间充质干细胞向胰岛β细胞的诱导分化。
[0065]5.免疫焚光检测胰岛素(insulin)表达
[0066]将大鼠骨髓间充质干细胞接种到PLGA支架表面，用胰岛β细胞诱导液诱导14天后制成冰冻切片，取冰冻切片用PBS缓冲液冲洗三次，每次5min ;用0.1 % Triton孵育1min以增加细胞膜的通透性；PBS缓冲液洗涤，用5% BSA/PBS于37°C孵育30min以封闭非特异性结合位点；倾去血清直接加入小鼠抗大鼠insulin单克隆抗体工作液，阴性对照用PBS代替抗体，置于湿盒中，4°C过夜；PBS缓冲液洗涤，加入山羊抗鼠IgG-TRITC工作液，于37°C孵育30min ；PBS缓冲液洗涤，用DAPI对细胞核进行衬染；PBS缓冲液洗涤后用荧光显微镜进行观察(图10)。免疫荧光显示，与对照组相比，PLGA支架组胰岛素分泌量明显增加。表明加入NaCl颗粒粒径大小为150?200 μ m、比例为50% (w/w)制备的PLGA支架可能比单层培养体系更好地模拟体内微环境，PLGA支架的三维结构更利于胰岛β细胞分泌胰岛素。
[0067]6.1nsulin 释放试验
[0068]将单层培养诱导分化组细胞和PLGA支架诱导分化组分别用PBS洗三次，无糖Krebs-Ringer缓冲液预孵育I个小时。PBS冲洗后，用低糖KR缓冲液(5.6mM葡萄糖)和高糖KR缓冲液(23mM葡萄糖)分别孵育I个小时。收集培养液表层，用电化学发光法(ECL)测定胰岛素含量。PLGA支架诱导分化组高糖孵育后胰岛素分泌量是低糖孵育胰岛素分泌量的2倍。而单层培养诱导分化组在高糖孵育和低糖孵育两种状态下胰岛素分泌量大致相同(图11)。表明NaCl颗粒粒径大小为150?200 μπκ比例为50% (w/w)制备的PLGA支架更好地模拟体内微环境，PLGA支架的三维结构可能比单层培养体系更利于使诱导分化形成胰岛β细胞具有高糖反应性。
[0069]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
【主权项】
1.一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料的制备方法，该制备方法如下: 将聚乳酸羟基乙酸，溶于1，4 二氧六环溶液中，配制成聚乳酸羟基乙酸浓度为10% w/V的溶液，所述的聚乳酸的分子量为15KD，其中聚乳酸:羟基乙酸的体积比为85:15 ; 向上述浓度为10% w/v的聚乳酸轻基乙酸溶液中加入粒径大小为100?250 μm，比例为25% -75% w/w的NaCl颗粒，搅拌后得到均匀悬液，倒入尺寸为8cmX8cm的培养皿；室温下干燥24小时以上，冷冻干燥24小时以上；脱模后用蒸馏水滤去多孔膜中的NaCl，室温干燥24小时以上，搅拌烧杯中的去离子水可加速NaCl颗粒的溶出，待NaCl颗粒完全溶出后干燥薄膜，密封保存，得到可用于骨髓间充质干细胞培养的多孔PLGA支架。2.根据权利要求1所述的用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料的制备方法，其特征在于所述的加入NaCl颗粒的粒径为150?200 μπι，占浓度为10% w/v的聚乳酸羟基乙酸溶液的比例为50% w/w。3.权利要求1或2的制备方法得到的用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料。4.一种如权利要求3所述的组织工程材料在诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化成胰岛β细胞中的应用。5.一种利用权利要求3所述的组织工程材料诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化成胰岛β细胞的方法，具体方法如下: Α.大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定 全骨髓贴壁培养法分离法获取大鼠骨髓间充质干细胞。传至第三代Ρ3后对培养获取的骨髓间充质干细胞分别进行形态学、表面标志物、功能鉴定； B.大鼠骨髓间充质干细胞在多孔PLAG支架表面进行诱导分化 取Ρ3代大鼠骨髓间充质干细胞，将细胞接种到根据权利要求1所述制备方法得到的已消毒的多孔PLGA支架表面，细胞接种密度为2.5 X 15个/24孔大小支架或4.5 X 10 4个/96孔大小支架，24小时后将普通培养液aMEM+10% FBS换为胰岛β细胞诱导液，胰岛β细胞诱导液A诱导10天后更换胰岛β细胞诱导液B继续诱导10天，每3天换液一次。6.根据权利要求5所述的组织工程材料诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化成胰岛β细胞的方法，其特征在于步骤A中全骨髓贴壁培养法分离法获取大鼠骨髓间充质干细胞的具体步骤为:将大鼠麻醉后处死，置于75%酒精中浸泡15min ;分离股骨和胫骨，PBS冲洗后，剪去干骺端，2ml医用注射器吸取培养基冲洗骨髓腔；将悬液过滤后，2000rpm/minX5min离心，沉淀吹打混匀后种于培养瓶中培养；骨髓间充质干细胞贴壁率达到70%后传代。7.根据权利要求5所述的组织工程材料诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化成胰岛β细胞的方法，其特征在于，步骤B中胰岛β细胞诱导液A在24孔板上每孔加入ImL培养基，96孔板上每孔加入0.1mL培养基；换胰岛β细胞诱导液B在24孔板上每孔加入ImL培养基，96孔板上每孔加入0.1mL培养基。8.根据权利要求5所述的组织工程材料诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化成胰岛β细胞的方法，其特征在于，其中步骤B中胰岛β细胞诱导液Α:含有10%FBS，1%非必需氨基酸，30ng/ml表皮生长因子，3% B27，30ng/ml成纤维细胞生长因子，3mmol/L L-谷氨酰胺的a MEM ;胰岛β细胞诱导液B:含10% FBS, 10ng/ml β -动物纤维素，10ng/ml激活素A,2%B27,10mmol/L尼克酰胺和30ng/ml成纤维细胞生长因子的a MEM,以上百分比均为体积百分比。
【专利摘要】本发明涉及生物医学工程技术领域，具体涉及一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料的制备方法及其应用。本发明的制备方法为：将骨髓间充质干细胞移植到PLGA支架，通过控制骨髓间充质干细胞种植的时间、浓度、方式以及支架材料的大小、形状等探索出适合骨髓间充质干细胞定向分化的最适条件，观察骨髓间充质干细胞和PLGA支架的生物相容性、诱导过程细胞形态变化、胰岛β细胞诱导液对细胞增殖的影响以及诱导分化细胞特异性基因、蛋白和功能的获得。本发明在最适条件下将骨髓间充质干细胞种植在PLGA支架上，经胰岛β细胞诱导液培养后分化获取了一种具有高糖反应性、可用于治疗移植的胰岛β细胞，为治疗糖尿病带来了希望。
【IPC分类】C12N5/0775, C12N5/071
【公开号】CN105670990
【申请号】
【发明人】石勇铨, 刘浩琪, 汤玮
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2014年11月18日